李樹雯，俞 琦，楊鳳嬌，李良紅

0 引 言

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是較為常見的臨床肺疾病，目前居世界疾病致死率第四位，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，普遍認(rèn)為COPD以氣管、支氣管、肺泡、肺間質(zhì)、肺部血管的慢性炎癥為特征[1-2]。而炎癥的發(fā)病機(jī)制與腫瘤壞死因子-α(tumer necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)等細(xì)胞因子介導(dǎo)炎性細(xì)胞在氣管、支氣管、肺泡、肺間質(zhì)等聚集、趨化、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，最終引起肺組織的慢性炎癥反應(yīng)[3-4]。而據(jù)報(bào)道TNF-α能增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule,ICAM-1)的表達(dá)[5]?？ń榫嗵呛怂?BCG-polysaccharide nucleic acid,BCG-PSN)是從卡介菌中提取的主要含多糖和核酸的非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，通過調(diào)節(jié)IL-2、干擾素、TNF-α等調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫功能[6]。臨床上卡介菌多糖核酸治療COPD應(yīng)用較為廣泛，但相關(guān)機(jī)理的研究較少，因此本研究觀察卡介菌多糖核酸注射液對(duì)慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠血清中ICAM-1、TNF-α、IL-2的影響，探討卡介菌多糖核酸注射液治療COPD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料健康清潔雄性SD大鼠60只，6～8周齡，體質(zhì)量200～250 g，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲食飲水，12 h光照周期，溫度18～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(浙)2018-0012]。利群牌香煙購自浙江煙草公司。大鼠ICAM-1、TNF-α、IL-2酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自美國ENDONGEN公司。脂多糖購自Sigma公司。自制吸煙染毒箱?？ń榫嗵呛怂嶙⑸湟嘿徸躁兾麽t(yī)藥控股集團(tuán)生物制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 COPD大鼠模型的建立將60只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、藥物組各20只。模型組和藥物組采用熏香煙加氣管內(nèi)注入脂多糖法建立大鼠COPD模型。給予對(duì)照組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)；模型組與藥物組在第1天及第15天向大鼠氣管內(nèi)注射1 g/mL脂多糖0.2 mL(當(dāng)天不進(jìn)行香煙熏染)，其他時(shí)間將模型組、藥物組大鼠每天暴露于煙霧中3次/d(每次間歇2 h)，每次10支香煙熏染30 min。造模期28 d。完成后進(jìn)行造模評(píng)價(jià)，從模型組、藥物組、對(duì)照組各取5只大鼠處死，取肺組織在光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化，綜合判斷造模是否成功。

1.2.2 給藥方法造模完成后，按大鼠與人體公斤體重劑量折算系數(shù)表折算，藥物組給予卡介菌多糖核酸注射液0.45 mg/kg腹腔注射，隔日1次。模型組、對(duì)照組給予等滲鹽水0.3 mL腹腔注射，隔日1次。

1.2.3 大鼠一般狀態(tài)觀察從造模開始每周觀察大鼠體重、精神狀態(tài)、皮毛是否光澤、活動(dòng)狀況、對(duì)刺激的反應(yīng)是否靈敏、口鼻分泌物、食欲、咳痰、咳喘、死亡等情況。

1.2.4 血清采集在第30天分別將對(duì)照組、模型組、藥物組大鼠用10%水合氯醛按300 mg/kg劑量腹腔麻醉后處死，抽心血2 mL于滅菌離心管，室溫靜置1 h后置4 ℃冰箱12 h，離半徑12 cm，以2000 r/min離心15 min，取血清待檢。

1.2.5 主要檢測(cè)指標(biāo)及方法采用雙抗體夾心ELISA法，取血清50 μL加入反應(yīng)孔，震蕩、混勻，37 ℃孵育，檢測(cè)大鼠血清中ICAM-1、TNF-α、IL-2的值。試驗(yàn)板設(shè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般狀態(tài)觀察及肺組織形態(tài)學(xué)變化對(duì)照組：大鼠精神狀態(tài)好，皮毛有光澤，無束毛，飲食、飲水正常，口鼻分泌物正常，呼吸平穩(wěn)。模型組：大鼠精神狀態(tài)萎靡，活動(dòng)減少，毛色晦暗，進(jìn)食量減少，頻發(fā)咳嗽，活動(dòng)后有明顯氣促，口鼻分泌物增多;光鏡下可見肺泡壁變薄、脹大、破裂等。藥物組經(jīng)治療后精神狀態(tài)、毛色、進(jìn)食量均明顯改善，咳嗽、活動(dòng)后氣促好轉(zhuǎn)。光鏡下肺組織的病理變化較模型組改善。

2.2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠血清ICAM-1、TNF-α、IL-2含量變化模型組大鼠血清中ICAM-1、TNF-α、IL-2含量與對(duì)照組比較均明顯增高(P<0.05)，而藥物組大鼠血清中的ICAM-1、TNF-α、IL-2含量較模型組明顯降低(P<0.05)，表明卡介菌多糖核酸注射液抑制大鼠血清中ICAM-1、TNF-α、IL-2的表達(dá)。見表1。

表1 COPD大鼠模型血清中ICAM-1、TNF-α、IL-2的表達(dá)情況

3 討 論

COPD是以進(jìn)行性氣流受限為特征的通氣功能障礙性肺部疾病，不完全可逆并進(jìn)行性發(fā)展，致病原因和發(fā)病機(jī)制均不確切，研究證實(shí)COPD是氣道、肺實(shí)質(zhì)以及肺血管的慢性炎癥為主要病理特征的疾病[7]。其氣道慢性炎癥是通過T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子介導(dǎo)的結(jié)果[8-9]。中性粒細(xì)胞的活化聚集，釋放中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、中性粒細(xì)胞組織蛋白酶G等多種蛋白酶引起慢性粘液高分泌狀態(tài)并導(dǎo)致肺實(shí)質(zhì)的破壞。隨著研究的深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到COPD亦具有自身免疫性疾病的特征，存在獲得性免疫的啟動(dòng)與失衡[10]。TNF-α、IL-2作為重要的炎癥因子在慢性炎癥性和自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要的作用[11]。TNF-α是一種由內(nèi)毒素激活的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等分泌的細(xì)胞因子。可以增加成纖維母細(xì)胞黏附分子(ICAM-1)的表達(dá)，從而促進(jìn)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的募集和活化，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[12]。同時(shí)TNF-α、IL-2等因子可加劇小氣道平滑肌及肺泡完成性的破壞，促進(jìn)支氣管的結(jié)構(gòu)重塑，影響氣道氣流的穩(wěn)定性[13-14]。

卡介菌多糖核酸是一種非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，通過調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞免疫、體液免疫，刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)來增強(qiáng)機(jī)體抗病能力，同時(shí)通過穩(wěn)定肥大細(xì)胞，減少脫顆粒細(xì)胞釋放活性物質(zhì)，達(dá)到抗炎平喘作用[15]，主要用于預(yù)防和治療慢性支氣管炎、感冒及哮喘。

本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心ELISA法，測(cè)定大鼠血清中ICAM-1、TNF-α、IL-2含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，COPD模型組ICAM-1、TNF-α、IL-2的表達(dá)顯著升高(P<0.05)，而藥物組與模型組相比較，ICAM-1、TNF-α、IL-2的含量明顯降低(P<0.05)，說明ICAM-1、TNF-α、IL-2表達(dá)與COPD相關(guān)，參與COPD病變的病理過程。筆者初步分析其升高的機(jī)理認(rèn)為：①當(dāng)感染時(shí)免疫復(fù)合物刺激單核-巨噬細(xì)胞合成釋放過量的ICAM-1、TNF-α、IL-2。②患者血中異常增高的TNF-α、IL-2激活炎癥細(xì)胞、氧自由基等，促使炎性介質(zhì)釋放、磷脂酶A2活化，致紅細(xì)胞滲出、白細(xì)胞浸潤(rùn)，中性粒細(xì)胞活化，內(nèi)毒素釋放，引起TNF-α、IL-2再升高[16]。同時(shí)卡介菌多糖核酸通過降低ICAM-1、TNF-α、IL-2的含量，延緩炎癥細(xì)胞的聚集、活化，抑制炎癥介質(zhì)的釋放，減輕肺組織的炎性病變?？傊緦?shí)驗(yàn)表明卡介菌多糖核酸不僅通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能治療COPD，而且抑制組織的炎性反應(yīng)，從而對(duì)COPD有較好的治療作用。