劉 容，方 瀟，高宇文，林飛飛，林志杰，陳榕彬，翁銘芳，吳衛(wèi)真

0 引 言

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其中約90%為尿路上皮癌[1]。肌層浸潤性膀胱癌復(fù)發(fā)率較高，預(yù)后較差，降低膀胱癌的復(fù)發(fā)率和死亡率是一個亟待解決的問題。龍葵是傳統(tǒng)中藥的十大抗癌藥物之一，澳洲茄堿(solasonine)是龍葵的重要抗癌成分。研究表明，澳洲茄堿在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌、肝癌等多種腫瘤中均具有抗腫瘤作用[2-4]。然而截止到2020年9月24日，檢索了PubMed、CNKI、萬方等數(shù)據(jù)庫，澳洲茄堿對膀胱癌的作用尚未見報道。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of Rapamycin, mTOR)是細胞生長、增殖的重要調(diào)節(jié)因子。本研究旨在觀察不同濃度的澳洲茄堿對體外培養(yǎng)的膀胱癌細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡的影響，并通過研究澳洲茄堿對J82細胞mTOR信號通路相關(guān)蛋白和mRNA表達的影響，初步闡明澳洲茄堿發(fā)揮抗腫瘤作用的分子機制，為進一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料澳洲茄堿(純度95%，中國楊凌慈緣生物技術(shù)有限公司)。J82、T24細胞(中國科學(xué)院上海細胞庫)，胎牛血清、細胞培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，CCK-8試劑盒(中國博士德公司)，二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO，美國Sigma公司)，碘化丙啶(Propidium iodide， PI，美國Sigma公司)，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)，EvoScipt RNA SYBR Green I Master試劑盒(瑞士Roche公司)，總RNA提取試劑盒(中國Bio Flux公司)，抗體β-actin、mTOR、p70S6K、p-mTOR、p-p70S6K(美國Cell Signaling Technology公司)，山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗(美國Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8檢測澳洲茄堿作用后膀胱癌J82、T24細胞的生存率將對數(shù)期生長的J82、T24細胞種植至96孔板中，2000個/孔，培養(yǎng)12 h至細胞貼壁。分別加入含有0、5、10、20、40 μmol/L澳洲茄堿的細胞培養(yǎng)液，0 μmol/L澳洲茄堿組加入含有0.3%DMSO的細胞培養(yǎng)液，每組設(shè)6個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，加入CCK-8，計算細胞生存率。獨立重復(fù)實驗4次。

1.2.2 流式細胞儀(fluorescence activating cell sorter，F(xiàn)ACS)檢測J82細胞凋亡J82細胞經(jīng)0、10、30 μmol/L澳洲茄堿處理24 h，胰酶消化后收集，PBS洗滌后加入結(jié)合液100 μL重懸，每組加入5 μL FITC Annexin V進行避光染色15 min后加入5 μL PI染色5 min。每組加入500 μL結(jié)合液重懸后上機檢測，得出細胞凋亡率。獨立重復(fù)實驗4次。

1.2.3 FACS檢測J82細胞周期取對數(shù)期生長J82細胞，傳代培養(yǎng)12 h至貼壁，設(shè)0 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L澳洲茄堿組，其中0 μmol/L組加入含有0.3%DMSO的培養(yǎng)基，10 μmol/L澳洲茄堿組和30 μmol/L澳洲茄堿組加入對應(yīng)濃度澳洲茄堿，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。胰酶消化、洗滌后重懸，用預(yù)冷70%乙醇溶液固定2 h，用5 μg/mL的PI溶液進行DNA染色，70 μmol/L濾網(wǎng)過濾后上機檢測，所得數(shù)據(jù)應(yīng)用ModFit LT軟件進行分析，得出細胞周期各期細胞百分比。

1.2.4 Western blot法檢測mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K蛋白表達將J82細胞分成0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L澳洲茄堿組，加入對應(yīng)培養(yǎng)液，其中0 μmol/L組加入含有0.3%DMSO的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后收取蛋白，雙辛酸(BCA)法檢測蛋白濃度，取30 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用4%BSA封閉1 h，加入1∶1000稀釋的一抗孵育15 h，洗膜后加入二抗孵育1 h，加入電化學(xué)發(fā)光液暗室曝光。

1.2.5 RT-qPCR法檢測mTOR、p70S6K mRNA表達將0 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L澳洲茄堿組J82細胞培養(yǎng)24 h后，應(yīng)用總RNA提取試劑盒提取總RNA并測定RNA濃度，根據(jù)EvoScipt RNA SYBR Green I Master試劑盒說明書配成反應(yīng)體系。mTOR引物序列：F：5′-ATGCTTGGAACCGGACCTG-3′， R：5′-TCTTGACTCATCTCTCGGAGTT-3′。 p70S6K引物序列：F：5′-CGGGACGGCTTTTACCCAG-3′，R：5′-TTTCTCACAATGTTCCATGCCA-3′。 β-actin引物序列：F：5′-GTTGTCGACGACGAGCG-3′，R：5′-GCACAGAGCCTCGCCTT-3′。每組三復(fù)孔，置于熒光定量PCR儀內(nèi)檢測。參數(shù)設(shè)置為:逆轉(zhuǎn)錄：60 °C，15 min；預(yù)保溫：95 ℃，10 min；擴增：95 ℃，10 s，58 ℃，30 s，45個循環(huán)；溶解曲線：95 ℃，1 min，25 ℃，1 min，95 ℃，15 s；冷卻：40 ℃，30 s。

2 結(jié) 果

2.1 澳洲茄堿抑制膀胱癌細胞J82、T24細胞增殖

2.1.1 澳洲茄堿抑制膀胱癌J82細胞增殖不同濃度的澳洲茄堿作用后，相同作用時間各組J82細胞生存率在整體上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。相同作用時間下，不同濃度的澳洲茄堿各組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。相同作用濃度下，不同培養(yǎng)時間的各組進行ANOVA檢驗，僅20 μmol/L澳洲茄堿組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.01)，其余各組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。雖然24 h各濃度組細胞生存率均高于48 h，但相同濃度不同作用時間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。CCK-8檢測結(jié)果見圖1。

2.1.2 澳洲茄堿抑制膀胱癌T24細胞增殖不同濃度的澳洲茄堿處理后，相同作用時間各組T24細胞生存率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。相同作用時間下，不同濃度的澳洲茄堿各組T24細胞間兩兩比較，除72 h 20 μmol/L和72 h 40 μmol/L組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.17)，其余各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。相同作用濃度下，不同培養(yǎng)時間的各組進行ANOVA檢驗，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

2.2 澳洲茄堿誘導(dǎo)J82細胞凋亡隨著澳洲茄堿濃度增高，J82細胞的凋亡率顯著增高，其中0、10和30 μmol/L澳洲茄堿組凋亡率分別為(0.93±0.26)%、(8.33±2.16)%、(29.53±7.63)%，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明澳洲茄堿能誘導(dǎo)J82細胞凋亡，這種誘導(dǎo)作用具有濃度依賴性。見圖3。

2.3 澳洲茄堿阻滯J82細胞周期S期澳洲茄堿作用后，J82細胞S期細胞增多，0、10、30 μmol/L澳洲茄堿組S期細胞百分比分別是(34.51±3.61)%、(39.34±3.21)%、(44.50±4.29)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.01)。G0/G1期細胞比例相應(yīng)減少，0、10、30 μmol/L澳洲茄堿組G0/G1期細胞百分比分別是(62.65±4.73)%、(57.51±3.37)%、(52.69±4.00)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.02)。而G2/M期細胞百分比無明顯變化。提示澳洲茄堿可引起J82細胞發(fā)生細胞周期阻滯，這種阻滯作用發(fā)生在S期。見圖4。

2.4 澳洲茄堿抑制J82細胞mTOR、p70S6K蛋白的磷酸化各組細胞mTOR、p70S6K蛋白表達未見明顯差異。隨著澳洲茄堿濃度增高，p-mTOR表達量逐漸減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=85.18，P<0.01)；p-p70S6K表達量逐漸減少, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=74.96，P<0.01)。表明澳洲茄堿能抑制mTOR蛋白的磷酸化、抑制p70S6K蛋白的磷酸化，從而抑制mTOR/p70S6K信號通路的激活。見圖5、圖6。

2.5 澳洲茄堿下調(diào)J82細胞mTOR、p70S6K mRNA表達隨著澳洲茄堿濃度增高，J82細胞mTOR mRNA表達量逐漸降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=31.49，P<0.01)；p70S6K mRNA表達量逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=47.08，P<0.01)。各組進行兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖7。

3 討 論

2015年全世界新發(fā)膀胱癌病例超過450 000例，膀胱癌在最常見的腫瘤中排名第9位[5]。膀胱癌的危險因素包括：年齡、性別、吸煙、飲水中砷的暴露史、職業(yè)性芳香胺接觸史、血吸蟲病、含非那西丁的止痛藥以及膀胱癌家族史[6]。與發(fā)達國家相比，發(fā)展中國家和不發(fā)達國家的膀胱癌患者生存率較低[7]。膀胱癌目前的主要治療手段是手術(shù)和化療，然而因腫瘤轉(zhuǎn)移導(dǎo)致其治療效果并不理想，患者預(yù)后較差[8]。即使應(yīng)用了最佳的治療方案，超過50%的膀胱癌患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，高達20%的患者可能進展為肌層浸潤性膀胱癌[9]。根治性膀胱切除術(shù)是肌層浸潤性膀胱癌的主要治療方法，但患者術(shù)后各種并發(fā)癥的發(fā)生率較高[10]。因此尋找對膀胱癌有效的新藥物是提高膀胱癌患者生存率的關(guān)鍵。

從天然藥物中發(fā)現(xiàn)低毒、高效的抗癌成分是新藥研發(fā)的重要途徑之一[11]。傳統(tǒng)中藥治療惡性腫瘤具有獨特的優(yōu)勢，可以通過提高自身免疫力、增強機體抗病能力達到驅(qū)除癌瘤的目的[12]。中藥龍葵具有清熱、解毒、消腫等功效，在臨床中廣泛應(yīng)用于肺癌、肉瘤、宮頸癌、乳腺癌等惡性腫瘤的治療中[13]。澳洲茄堿，分子式：C45H73NO16，是龍葵發(fā)揮抗癌作用的主要活性成分。研究表明，澳洲茄堿可以顯著抑制結(jié)腸癌、乳腺癌、宮頸癌、肝癌、膠質(zhì)母細胞瘤等細胞的增殖，其半數(shù)抑制濃度波動于6.01～26.21 μg/mL[14]。Liu等[4]發(fā)現(xiàn)，澳洲茄堿可以通過對miR-375-3p和lncRNA CCAT1的相互調(diào)解，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子SP1介導(dǎo)的IRF5表達減少，從而抑制肝癌HepG2細胞的增殖。Smo基因突變和Gli基因擴增可以使腫瘤細胞發(fā)生原發(fā)性和獲得性的耐藥，澳洲茄堿可以通過抑制Hh信號通路，降低Gli的表達從而對抗腫瘤細胞的耐藥性[15]。

J82細胞、T24細胞均為人膀胱移行癌細胞，屬于浸潤性膀胱癌細胞[16-17]。CCK-8結(jié)果表明澳洲茄堿作用后，J82、T24細胞的存活率降低。并且隨著澳洲茄堿的濃度增加，這種抑制作用增強，說明澳洲茄堿能顯著抑制J82、T24細胞的增殖，并且這種抑制作用具有濃度依賴性。然而延長澳洲茄堿的作用時間，并不能顯著增強這種抑制作用，提示這種抑制作用無明顯時間依賴性。

細胞凋亡和細胞周期結(jié)果表明，澳洲茄堿可誘導(dǎo)J82細胞凋亡并且引起J82細胞發(fā)生細胞周期阻滯，阻滯發(fā)生在S期。不同濃度組進行兩兩比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示澳洲茄堿誘導(dǎo)J82細胞凋亡和引起J82細胞阻滯的作用均具有濃度依賴性。

mTOR/p70S6K信號通路是一條復(fù)雜的信號通路，包含許多下游分子，廣泛參與許多細胞進程，包括細胞生長和存活、細胞周期、細胞凋亡、細胞自噬、蛋白合成、血管再生、細胞遷移和膜運輸?shù)萚18-22]。mTOR蛋白經(jīng)過磷酸化后活化，進一步引起下游靶蛋白p70S6K磷酸化，進而激活mTOR信號通路，促進細胞生長，抑制細胞自噬和凋亡，有利于細胞周期進展，加速細胞的增殖[23-24]。因此，抑制mTOR、p70S6K蛋白的磷酸化的藥物可以通過抑制mTOR信號通路的傳導(dǎo)發(fā)揮抗腫瘤作用。

為了進一步研究澳洲茄堿抑制膀胱癌細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡、阻滯細胞周期的分子機制，本研究分析了澳洲茄堿對J82細胞mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K蛋白表達的影響和對mTOR、p70S6K的mRNA表達的影響。結(jié)果顯示各組細胞mTOR和p70S6K蛋白的表達量無明顯差異，p-mTOR、p-p70S6K表達量顯著減少，mTOR、p70S6K的mRNA表達下調(diào)，提示澳洲茄堿可能同時通過抑制mTOR和p70S6K蛋白的磷酸化、下調(diào)mTOR和p70S6K的mRNA表達，從而抑制mTOR信號通路的激活，發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)澳洲茄堿在體外能顯著抑制J82、T24細胞增殖、誘導(dǎo)J82細胞凋亡、阻滯J82細胞周期，這種作用呈濃度依賴性。其分子機制可能是通過抑制mTOR和p70S6K蛋白的磷酸化、下調(diào)mTOR和p70S6K的mRNA表達。澳洲茄堿有望解開肌層浸潤性膀胱癌治療的難題，成為新的膀胱癌治療藥物。本研究僅在體外初步探索了澳洲茄堿對膀胱癌細胞的抗腫瘤作用，澳洲茄堿對mTOR通路其他分子的表達和磷酸化是否有影響以及在動物體內(nèi)是否仍有抑制膀胱癌細胞生長的作用，尚有待進一步驗證。