張建海,俞建洪

張建海,俞建洪, 紹興文理學(xué)院附屬醫(yī)院(紹興市立醫(yī)院)老年醫(yī)學(xué)科浙江省紹興市 312000

0 引言

胃癌是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,其發(fā)病率逐年上升,已嚴(yán)重威脅人類生命安全,由于胃癌發(fā)病初期較為隱匿導(dǎo)致大部分患者確診時已處于癌癥晚期,失去最佳治療時機(jī),隨著不斷深入研究以及研發(fā)新型治療藥物,胃癌患者預(yù)后明顯改善,但患者的遠(yuǎn)期生存情況不佳,而化療藥物具有較強(qiáng)的毒副作用從而限制其應(yīng)用[1,2].因而研發(fā)治療效果好且副作用小的藥物具有重要意義.天然中藥的提取物成為治療癌癥的熱點(diǎn)研究,研究表明部分中藥提取物具有抗胃癌的作用,但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未闡明[3,4].翠云草屬于卷柏科卷柏屬植物,其具有清熱解毒、止血等作用,其主要活性成分為黃銅,研究表明翠云草總黃酮(total flavones of Selaginella uncinata (Desv.) spring,TFS)可抑制肺癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯[5].但翠云草總黃酮對胃癌的治療效果及其可能作用機(jī)制尚未闡明.環(huán)狀RNA (circular RNA,circRNA)在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中可能發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用,環(huán)狀RNA_0009910(circular RNA_0009910,circ_0009910)在胃癌細(xì)胞中表達(dá)水平升高,并可促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲[6].但翠云草總黃酮是否以circ_0009910為作用靶點(diǎn)而發(fā)揮作用尚未可知.因此,本研究主要探討翠云草總黃酮對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及糖酵解水平的影響,探究其對circ_0009910的調(diào)控作用.

1 材料和方法

1.1 材料 翠云草購自三原天域生物制品有限公司;胃癌細(xì)胞AGS購自美國ATCC細(xì)胞庫;DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司;Lipofectamine2000購自美國Thermo Fisher公司;Trizol試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;熒光定量檢測試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;pcDNA3.1購自上海索寶生物科技有限公司;MTT購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司;乳酸水平檢測試劑盒與葡萄糖消耗檢測試劑盒購自美國Bivision公司;兔抗人Bax、Bcl-2抗體購自美國CST公司;HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司.

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組:翠云草總黃酮制備:精確稱量1000 g翠云草,研磨呈粉狀,使用60目篩過濾,阿計(jì)入60%乙醇后加熱處理20 min,收集濾液,減壓,蒸發(fā),烘干,加入吸附樹脂進(jìn)行純化,加入70%乙醇洗脫,濃縮干燥后獲得翠云草提取物,以蘆丁為對照品,翠云草提取物中加入甲醇進(jìn)行溶解,應(yīng)用酶標(biāo)儀進(jìn)行掃描,在波長510 nm處有最大吸收峰,其吸收光譜與蘆丁相似,同時以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)回歸方程計(jì)算翠云草提取物中的總黃酮含量(2.68 mg/g),翠云草總黃酮加入DMSO進(jìn)行溶解,配置濃度為1 mg/mL的母液,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行稀釋液,濃度分別為5 μg/mL、15 μg/mL、25 μg/mL[7].

胃癌細(xì)胞AGS接種于96孔板(1×104個/孔),分別加入不同濃度(5 μg/mL、15 μg/mL、25 μg/mL)的翠云草總黃酮干預(yù)24 h,分別記作TFS-L組、TFS-M組、TFS-H組.同時將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為Con組.參照Lipofectamine2000說明書分別將pcDNA、pcDNAcirc_0009910轉(zhuǎn)染至AGS細(xì)胞,加入含有濃度為25 μg/mL 翠云草總黃酮的培養(yǎng)液處理24 h,分別記作TFSH+pcDNA組、TFS-H+pcDNA-circ_0009910組.

1.2.2 MTT檢測細(xì)胞增殖:收集各組AGS細(xì)胞(3×104個/mL)接種于96孔板(100 μL/孔),每孔加入20 μL MTT溶液,置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h,棄上清,分別加入150 μL DMSO,室溫孵育10 min,應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔在波長490 nm處的光密度值(OD值).

1.2.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn):收集各組AGS細(xì)胞種于細(xì)胞培養(yǎng)皿(200個/皿),置于培養(yǎng)箱孵育24 h,棄舊培養(yǎng)基,PBS洗滌,加入消化液消化,加入含有10%胎牛血清培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液,接種于6孔板(200個/孔),置于培養(yǎng)箱孵育,每3 d更換一次培養(yǎng)液,14 d后出現(xiàn)肉眼可見細(xì)胞克隆的形成,移除培養(yǎng)液,加入PBS洗滌,加入0.1%結(jié)晶紫染色20 min,清水洗滌,觀察細(xì)胞克隆形成數(shù),高于50個克隆數(shù)即為有效克隆.

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率:收集各組AGS細(xì)胞,預(yù)冷PBS洗滌,細(xì)胞沉淀中加入500 μL結(jié)合緩沖液,參照細(xì)胞凋亡檢測試劑盒依次分別加入5 μL Annexin V-FITC與5 μL PI,室溫振蕩孵育10 min,應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀及應(yīng)用Cellauest軟件檢測各組細(xì)胞凋亡率.

1.2.5 檢測細(xì)胞中葡萄糖消耗及乳酸水平:采用乳酸脫氫酶比色法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)基中的乳酸含量,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作.根據(jù)葡萄糖消耗檢測試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞葡萄糖消耗,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作.

1.2.6 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(q R T-P C R)檢測c i r c_0009910的表達(dá)水平:收集各組A G S細(xì)胞,采用Tr i z o l法提取細(xì)胞總R N A.參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成c D N A.c i r c_0009910正向引物5’-GCCAGCTGTGAGTGTT TCTT-3’,反向引物:5’-CGCATCGATCAG CTACACG-3’;GAPDH正向引物5’-GGAGCGAGATCCCTC CAAAAT-3’,反向引物:5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3,引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成.以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系:10×PCR Buffer 2.5 μL,MgSO42.5 μL,dNTPs 2.5 μL,正反向引物各0.5 μL,cDNA 2 μL,RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至25 μL;反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性2 min,95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共36次循環(huán).circ_0009910以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算circ_0009910相對表達(dá)量.

1.2.7 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測Bax、Bcl-2蛋白表達(dá):收集各組AGS細(xì)胞,加入蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白,采用BCA法測定蛋白濃度,取50 μg變性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE),轉(zhuǎn)膜,封閉,分別加入一抗稀釋液(1:1000),4 ℃孵育24 h,TBST洗滌,加入二抗稀釋液(1:2000),室溫孵育1 h,TBST洗滌,暗室內(nèi)曝光顯影,應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料以mean±SD表示且均符合正態(tài)分布,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 翠云草總黃酮對胃癌細(xì)胞AGS增殖的影響 與Con組比較,TFS-L組、TFS-M組、TFS-H組細(xì)胞活力顯著降低(P＜0.05),克隆形成數(shù)顯著減少(P＜0.05),且TFS-L組、TFS-M組、TFS-H組各指標(biāo)比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見表1.

2.2 翠云草總黃酮對胃癌細(xì)胞AGS凋亡的影響 與Con組比較,TFS-L組、TFS-M組、TFS-H組凋亡率顯著升高(P＜0.05),Bax蛋白水平顯著升高(P＜0.05),Bcl-2蛋白水平顯著降低(P＜0.05),且TFS-L組、TFS-M組、TFS-H組各指標(biāo)比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見圖1、表2.

2.3 翠云草總黃酮對胃癌細(xì)胞AGS中糖酵解水平的影響 與Con組比較,TFS-L組、TFS-M組、TFS-H組葡萄糖消耗、乳酸水平顯著降低(P＜0.05),且TFS-L組、TFS-M組、TFS-H組各指標(biāo)比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見表3.

2.4 翠云草總黃酮對胃癌細(xì)胞AGS中circ_0009910表達(dá)量的影響 與Con組比較,TFS-L組、TFS-M組、TFS-H組circ_0009910的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05),且TFS-L組、TFS-M組、TFS-H組間circ_0009910的表達(dá)水平比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見表4.

2.5 circ_0009910過表達(dá)可降低翠云草總黃酮對胃癌細(xì)胞AGS增殖及凋亡的作用 與TFS-H+pcDNA組比較,TFS-H+pcDNA-circ_0009910組細(xì)胞活力顯著升高(P＜0.05),克隆形成數(shù)顯著增多(P＜0.05),凋亡率顯著降低(P＜0.05),Bax蛋白水平顯著降低(P＜0.05),Bcl-2蛋白水平顯著升高(P＜0.05),見圖2、表5.

2.6 circ_0009910過表達(dá)可降低翠云草總黃酮對胃癌細(xì)胞AGS中糖酵解水平的作用 與TFS-H+pcDNA組比較,TFS-H+pcDNA-circ_0009910組葡萄糖消耗、乳酸水平顯著升高(P＜0.05),見表6.

3 討論

目前多數(shù)研究表明中藥具有抗胃癌等作用,并可能通過調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等從而發(fā)揮作用,但關(guān)于其作用機(jī)制尚未完全闡明[8,9].circRNA在胃癌發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用,并可能作為胃癌靶向治療的潛在靶點(diǎn)[10].但circRNA是否可介導(dǎo)中藥提取物對胃癌的治療過程尚未闡明.

翠云草黃酮類化合物具有抗氧化、抗腫瘤等作用,但其對胃癌的治療效果及其可能作用機(jī)制尚未闡明[11-13].本研究結(jié)果顯示不同濃度的翠云草總黃酮可降低胃癌細(xì)胞活力,減少克隆形成數(shù),且呈劑量依賴性,提示翠云草總黃酮可抑制胃癌細(xì)胞增殖.細(xì)胞增殖與凋亡失衡是促進(jìn)胃癌等腫瘤發(fā)生及發(fā)展的重要原因之一,細(xì)胞凋亡過程中Bcl-2表達(dá)上調(diào)可抑制細(xì)胞凋亡,Bax表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14].本研究結(jié)果顯示不同濃度的翠云草總黃酮可提高細(xì)胞凋亡率,促進(jìn)Bax表達(dá)及抑制Bcl-2表達(dá),且呈劑量依賴性,提示翠云草總黃酮可促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡.糖酵解水平升高可促進(jìn)胃癌等腫瘤增殖、細(xì)胞遷移及侵襲[15].本研究結(jié)果顯示不同濃度的翠云草總黃酮可降低胃癌細(xì)胞中葡萄糖消耗、乳酸水平,且隨著藥物劑量的升高而顯著降低,提示翠云草總黃酮可抑制糖酵解反應(yīng)從而抑制胃癌細(xì)胞增殖.

circ_0009910表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[16].沉默circ_0009910可通過促進(jìn)miR-20a-5p表達(dá)而抑制急性髓性白血病細(xì)胞的生長[17].circ_0009910通過調(diào)控miR-335-5p/ROCK1分子軸促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[18].本研究結(jié)果顯示不同濃度的翠云草總黃酮處理后胃癌細(xì)胞中circ_0009910的表達(dá)水平明顯降低,而circ_0009910過表達(dá)后可明顯減弱翠云草總黃酮對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及糖酵解的作用.

4 結(jié)論

綜上所述,翠云草總黃酮可通過下調(diào)circ_0009910的表達(dá)從而抑制胃癌細(xì)胞增殖、糖酵解反應(yīng)及促進(jìn)細(xì)胞凋亡,為進(jìn)一步闡釋翠云草總黃酮抗腫瘤作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).但關(guān)于circ_0009910如何調(diào)控下游基因表達(dá)及其可能作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

胃癌發(fā)病機(jī)制尚未闡明,由于胃癌早期臨床癥狀不明顯導(dǎo)致大部分患者確診時已處于晚期,失去最佳治療時機(jī),化療等藥物對人體造成一定損害,而天然植物提取物具有抗胃癌等作用,但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未闡明.

實(shí)驗(yàn)動機(jī)

翠云草總黃酮的主要活性成分為黃銅,其具有抗炎、抗氧化與抗腫瘤等作用,但翠云草總黃酮對胃癌的治療效果尚未可知,因而本研究采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證翠云草總黃酮對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及糖酵解水平的影響,為胃癌的治療提供新方向.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

翠云草總黃酮具有抗胃癌的作用,其作用機(jī)制可能通過調(diào)控circ_0009910的表達(dá)而實(shí)現(xiàn).

實(shí)驗(yàn)方法

采用MTT實(shí)驗(yàn)與平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測翠云草總黃酮對胃癌細(xì)胞增殖能力的影響;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測翠云草總黃酮對胃癌細(xì)胞凋亡能力的影響;根據(jù)試劑盒檢測翠云草總黃酮對胃癌細(xì)胞糖酵解水平的影響;采用qRTPCR實(shí)驗(yàn)檢測翠云草總黃酮對胃癌細(xì)胞中circ_0009910表達(dá)水平的影響;circ_0009910過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入胃癌細(xì)胞后加入翠云草總黃酮培養(yǎng),采用上述方法檢測細(xì)胞增殖、凋亡及糖酵解水平.

表1 翠云草總黃酮對胃癌細(xì)胞AGS增殖的影響(mean±SD,n=9)

表2 翠云草總黃酮對胃癌細(xì)胞AGS凋亡的影響(mean±SD,n=9)

表3 翠云草總黃酮對胃癌細(xì)胞AGS中糖酵解水平的影響(mean±SD,n=9)

表4 翠云草總黃酮對胃癌細(xì)胞AGS中circ_0009910表達(dá)量的影響(mean±SD,n=9)

表5 circ_0009910過表達(dá)可降低翠云草總黃酮對胃癌細(xì)胞AGS增殖及凋亡的作用(mean±SD,n=9)

表6 circ_0009910過表達(dá)可降低翠云草總黃酮對胃癌細(xì)胞AGS中糖酵解水平的作用(mean±SD,n=9)

圖1 翠云草總黃酮對胃癌AGS細(xì)胞凋亡的影響.A:流式細(xì)胞術(shù)檢測AGS細(xì)胞凋亡;B:Western blot法檢測Bax、Bcl-2蛋白表達(dá).

圖2 circ_0009910過表達(dá)可降低翠云草總黃酮對胃癌細(xì)胞AGS凋亡的作用.A:流式細(xì)胞術(shù)檢測AGS細(xì)胞凋亡;B:Western blot法檢測Bax、Bcl-2蛋白表達(dá).

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

翠云草總黃酮可抑制胃癌細(xì)胞增殖及降低糖酵解水平,并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;circ_0009910過表達(dá)可明顯逆轉(zhuǎn)翠云草總黃酮對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及糖酵解水平的作用.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

翠云草總黃酮可抑制胃癌細(xì)胞增殖、糖酵解反應(yīng)及促進(jìn)細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制可能與下調(diào)circ_0009910的表達(dá)有關(guān).

展望前景

circ_0009910可充當(dāng)miRNA的海綿分子,關(guān)于其如何調(diào)控下游miRNA表達(dá)而參與胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及糖酵解反應(yīng)過程尚需進(jìn)一步探究.