宋磊，劉苗苗，郭燕風(fēng)，王宜磊*

1. 菏澤學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院（菏澤 274000）；2. 山東丹紅制藥有限公司（菏澤 274000）

透明質(zhì)酸（HA）是一種高分子酸性黏多糖，有獨特的流變學(xué)特性、黏彈性、保濕性及良好的生物相容性，被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[1-5]。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸周期短，環(huán)境友好，產(chǎn)量高，是目前最主要生產(chǎn)方法[6-9]。葡萄糖作為發(fā)酵生產(chǎn)的唯一碳源，除少量用于菌體代謝增殖外，主要作為底物用于透明質(zhì)酸的合成，是對發(fā)酵過程控制及判定發(fā)酵終止時間的重要參數(shù)[10-11]。透明質(zhì)酸發(fā)酵液中還原糖含量的測定多采用3, 5-二硝基水楊酸（DNS）比色法[12-14]，方法操作繁瑣、耗時長、人為誤差大，不能實時監(jiān)測發(fā)酵液中還原糖含量。但透明質(zhì)酸發(fā)酵生產(chǎn)周期短，發(fā)酵液各參數(shù)變化速度快，尤其在發(fā)酵衰亡期，菌體自溶裂解后釋放大量透明質(zhì)酸酶，使透明質(zhì)酸快速降解，極大地影響透明質(zhì)酸生產(chǎn)收率及后

續(xù)分離與純化。因此快速估測出透明質(zhì)酸發(fā)酵液中還原糖含量對生產(chǎn)實踐有很重要的指導(dǎo)意義。查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻，發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)過程中還原糖含量的測定常采用傳統(tǒng)的手工滴定法或比色法[15]，鮮見有對發(fā)酵液中還原糖含量與其他發(fā)酵過程參數(shù)相偶聯(lián)，通過快速檢測其他過程參數(shù)而快速估測還原糖含量的相關(guān)報道。陳莉等[16]提出基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)快速估測發(fā)酵液中羊肚菌胞外多糖的含量，劉靜等[17]通過測定水溶液中濁度快速估測出水中殼聚糖含量，均取得有益的研究經(jīng)驗。結(jié)合工廠生產(chǎn)實踐，通過對透明質(zhì)酸發(fā)酵過程中發(fā)酵液中還原糖含量與其他幾個重要參數(shù)的相關(guān)性及變化規(guī)律分析，構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，以期能達到快速估測出發(fā)酵液中還原糖含量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

發(fā)酵液（山東某生物工程公司）。

咔唑、氫氧化鈉、亞硫酸鈉、3, 5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、四硼酸鈉、結(jié)晶酚（上海麥克林生化科技有限公司）；硫酸、氫氧化鈉（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；葡萄糖醛酸、葡萄糖標準品（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

PL203/01電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；DV2TRV旋轉(zhuǎn)黏度計（美國博勒飛（廣州）有限公司）；WGZ-200濁度儀（上海昕瑞儀器儀表有限公司）；HK338電導(dǎo)率儀（北京華科儀科技有限公司）；UV5800分光光度計（上海元析儀器有限公司）；H1650離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；DZF6090真空干燥箱（上海皓莊儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵液取樣

透明質(zhì)酸發(fā)酵周期短，發(fā)酵過程中各參數(shù)變化快。選定從發(fā)酵開始，間隔2 h取樣；取2019030901、2019031503、2019040201這3個發(fā)酵批次同一發(fā)酵時間節(jié)點發(fā)酵液，檢測其中還原糖含量、透明質(zhì)酸含量、菌體量、濁度、黏度、電導(dǎo)率。

1.2.2 發(fā)酵液中菌體、透明質(zhì)酸、還原糖含量變化曲線

對3個批次同一時間節(jié)點測得菌體、透明質(zhì)酸、還原糖含量取平均值，繪制曲線。

1.2.3 還原糖含量與發(fā)酵液中各參數(shù)相關(guān)性分析

對3個批次同一時間節(jié)點測得還原糖含量、透明質(zhì)酸含量、菌體量、濁度、黏度、電導(dǎo)率取平均值，繪制發(fā)酵液中還原糖含量與其他各參數(shù)相關(guān)性散點圖，并根據(jù)SPSS 19.0軟件分析結(jié)果，考察其相關(guān)性。

1.2.4 構(gòu)建數(shù)學(xué)模型

篩選出與發(fā)酵液中還原糖含量變化規(guī)律相關(guān)顯著性參數(shù)，利用軟件構(gòu)建一元線性、二次項曲線、BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)3種數(shù)學(xué)模型，用于預(yù)測未知發(fā)酵液中還原糖含量。

1.2.5 3種數(shù)學(xué)模型預(yù)測效果比較

對2019060401、2019060503兩個批次隨機13個發(fā)酵液樣品中還原糖含量及與其相關(guān)性顯著參數(shù)的含量進行測定；利用一元線性回歸、二次項曲線回歸分析及BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)3種數(shù)據(jù)處理方法獲得數(shù)學(xué)模型對發(fā)酵液中還原糖含量進行估測；將實測值與模型估測值進行對比，依據(jù)試驗樣本方差作為3種模型的評價指標，用于檢驗?zāi)Ｐ偷臏蚀_性。方差計算如式（1）所示。

式中：S2為方差；Y1為數(shù)學(xué)模型計算值；Y2為試驗測得實測值。

1.2.6 發(fā)酵過程中各參數(shù)測定方法

發(fā)酵液中還原糖的測定參考文獻[12-14]。稱取6.3 g 3, 5-二硝基水楊酸（DNS）溶于少量蒸餾水中，加入262 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液，加入185 g酒石酸鈉鉀、5 g結(jié)晶酚、5 g亞硫酸鈉，搖勻，冷卻后定容至1 000 mL棕色容量瓶中，于4 ℃冰箱中放置7 d備用。精密量取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mL 1.14 mg/mL無水葡萄糖對照品溶液于6個20 mL具塞試管中，補充蒸餾水至2 mL混勻，加入1.5 mL DNS試液，搖勻后置沸水浴保持5 min，冷卻至室溫，定容至mL，搖勻。同時，以水為空白管對照，采用分光光度計測定540 nm波長處的吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標，葡萄糖濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線。取透明質(zhì)酸發(fā)酵液適當稀釋后，取1.0 mL溶液置20 mL具塞試管中，按照上述方法，自“補充蒸餾水至2 mL……”測定。根據(jù)標準曲線，計算供試品中還原糖含量。

透明質(zhì)酸測定采用Bitter-Muir法[18-23]；發(fā)酵液黏度采用數(shù)顯旋轉(zhuǎn)黏度計測定，控溫度35 ℃，根據(jù)不同黏度，選擇合適轉(zhuǎn)子及轉(zhuǎn)速測定讀數(shù)；電導(dǎo)率采用電導(dǎo)率儀測定，控溫25 ℃測定；濁度測定，對發(fā)酵液稀釋10倍后，采用濁度儀測定；發(fā)酵液中還原糖測定[12-14]，采用3, 5-二硝基水楊酸（DNS）比色法；發(fā)酵液中菌體含量測定[24]，采取干重法，根據(jù)透明質(zhì)酸發(fā)酵液黏度液稀釋一定倍數(shù)后離心取沉淀，洗滌1次，60 ℃真空干燥至恒質(zhì)量，稱取質(zhì)量計算細胞濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及散點圖繪制；SPSS 19.0軟件用于相關(guān)性分析、偏相關(guān)分析、一元線性模型及二次項曲線模型構(gòu)建；Matlab 2014軟件用于構(gòu)建BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型；對3個批次發(fā)酵過程測得各參數(shù)取平均值用于相關(guān)性分析；3個批次各參數(shù)測得全部數(shù)據(jù)構(gòu)建數(shù)學(xué)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液中菌體、透明質(zhì)酸、還原糖含量變化曲線

對3個批次同一時間節(jié)點測得菌體量、透明質(zhì)酸含量、還原糖含量取平均值，繪制曲線。結(jié)果如圖1和圖2所示。

從圖1可知，0～2 h為菌體生長的調(diào)整期，菌體量很少；2～10 h為對數(shù)生長期，菌體快速生長繁殖；10～18 h菌體進入穩(wěn)定期，菌體量始終保持在高位；18 h后進入衰亡期，菌體開始自溶。從圖2可以看出，0～6 h透明質(zhì)酸產(chǎn)量很少；6～16 h透明質(zhì)酸快速積累；18 h后透明質(zhì)酸開始降解，產(chǎn)量下降。還原糖含量2 h開始下降速度加快，主要用于菌體代謝繁殖及透明質(zhì)酸前體合成；14 h菌體量趨于穩(wěn)定，透明質(zhì)酸前體大量合成，還原糖含量下降速度趨于平緩，18 h后還原糖含量趨于穩(wěn)定。

2.2 還原糖含量與發(fā)酵液中各參數(shù)相關(guān)性分析

繪制散點圖，考察發(fā)酵液中還原糖含量與透明質(zhì)酸含量、菌體量、濁度、黏度、電導(dǎo)率變化規(guī)律的相關(guān)性。結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以直觀地看出，發(fā)酵液中還原糖含量與透明質(zhì)酸含量、黏度相關(guān)性顯著，與菌體量存在一定相關(guān)性，與電導(dǎo)率、濁度相關(guān)性不顯著。采用SPSS軟件進行pearson相關(guān)檢驗分析，表1給出還原糖含量與透明質(zhì)酸（HA）、菌體量、濁度、黏度、電導(dǎo)率各參數(shù)之間相關(guān)性系數(shù)。由表1可知，當顯著性水平p＜0.01時，發(fā)酵液中還原糖含量與發(fā)酵液濁度、電導(dǎo)率變化不存在相關(guān)性，與發(fā)酵液中透明質(zhì)酸、菌體量、黏度變化呈顯著性相關(guān)。

圖1 菌體生長曲線

圖2 透明質(zhì)酸、還原糖含量變化曲線

圖3 還原糖與各參數(shù)散點圖

單純利用相關(guān)系數(shù)來評價變量間的相關(guān)性還不夠準確，還需要在剔除其他相關(guān)因素影響的條件下計算變量間的偏相關(guān)系數(shù)[16]。經(jīng)偏相關(guān)分析，結(jié)果見表2?？刂起ざ燃巴该髻|(zhì)酸含量2個變量，還原糖含量與菌體量相關(guān)性系數(shù)為0.300，顯著性水平為0.433，遠大于0.05，表明兩者存在虛假性相關(guān)。控制其他2個變量，在顯著性水平p≤0.01時還原糖含量與透明質(zhì)酸、黏度變化規(guī)律呈顯著性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.887和0.799。這是由于發(fā)酵液中葡萄糖除了少部分用于菌體生長繁殖外，絕大部分是作為底物用于合成透明質(zhì)酸，其流程是葡萄糖經(jīng)糖酵解（EMP）途徑形成6-磷酸果糖，在酶的作用下形成6-磷酸葡萄糖胺，6-磷酸葡萄糖胺經(jīng)乙酰化后合成尿苷二磷酸-N-?；?氨基葡萄糖；尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸通過糖醛酸途徑合成。透明質(zhì)酸合成酶交替地將尿苷二磷酸-N-?；?氨基葡萄糖和尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸以每分鐘約100個糖單位的速度快速添加到HA分子鏈上，同時逐漸增長的HA鏈會穿過質(zhì)膜被送到胞外基質(zhì)中[10-11]。故發(fā)酵液中還原糖含量與透明質(zhì)酸含量變化表現(xiàn)出較強的相關(guān)性。透明質(zhì)酸水溶液由于其分子內(nèi)和分子間的作用，具有非牛頓流體的流變學(xué)特性及黏彈性。透明質(zhì)酸濃度較低，溶液的黏度隨濃度變化相對較小，但濃度達到某一閾值時，溶液的黏度隨濃度增加而快速提高，并表現(xiàn)出很強的相關(guān)性，因此發(fā)酵液中還原糖含量與黏度也表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性。結(jié)合兩變量相關(guān)性及偏相關(guān)分析，發(fā)酵液黏度與發(fā)酵液中透明質(zhì)酸均可預(yù)測發(fā)酵液中還原糖含量?？紤]到發(fā)酵液黏度檢測可通過旋轉(zhuǎn)黏度計直接讀數(shù)，方法簡單；發(fā)酵液中透明質(zhì)酸檢測步驟繁瑣、時間長、誤差大情況，選定發(fā)酵液黏度作為描述發(fā)酵液中還原糖含量變化的唯一變量。

表1 還原糖與各參數(shù)相關(guān)系數(shù)

表2 還原糖與各參數(shù)的偏相關(guān)系數(shù)

2.3 構(gòu)建數(shù)學(xué)模型

取3個發(fā)酵批次33組試驗數(shù)據(jù)用于數(shù)學(xué)模型的構(gòu)建，采用SPSS 19.0進行一元線性回歸和二項式曲線回歸分析；采用Matlab 2014構(gòu)建BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。式中Y代表發(fā)酵液中還原糖含量，X代表黏度。

2.3.1 一元線性回歸

對33組試驗數(shù)據(jù)進行一元線性回歸分析。Y=-0.380 3X+49.790 7。

經(jīng)分析得，該線性方程復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.993 2，判定系數(shù)R2=0.904 3，表明擬合效果較好；模型殘差進行獨立性檢驗DW=0.438 0，查詢Durbin Watson table可以發(fā)現(xiàn)DW值恰好出在無自相關(guān)性的值域之中，認定殘差獨立，通過檢驗；回歸方程顯著性檢驗的概率p=0.000＜0.01，表明由自變量黏度和因變量還原糖含量建立的線性關(guān)系回歸模型具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3.2 二次項曲線回歸分析

二次項曲線回歸分析模型為Y=53.211 1-0.848 0X+0.003 648X2。

經(jīng)分析得，回歸方程顯著性檢驗的F=122.268 2，判定系數(shù)R2=0.968 3，回歸方程顯著性檢驗的概率p=0.000，說明模型高度顯著。

2.3.3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)

BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是一種按誤差反向傳播訓(xùn)練的多層前饋網(wǎng)絡(luò)，具有很強的非線性映射能力，能很好地應(yīng)用于非線性預(yù)測問題[25-27]。取33組試驗數(shù)據(jù)構(gòu)建3層結(jié)構(gòu)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[24-26]，輸入層、輸出層各一個神經(jīng)元，分別代表發(fā)酵液黏度和發(fā)酵液中還原糖含量，輸入層到隱含層的傳遞函數(shù)為logsig函數(shù)，隱含層到輸出層之間選擇purline線性傳遞函數(shù)。網(wǎng)格訓(xùn)練函數(shù)采用應(yīng)用Levenberg-Marquardt優(yōu)化后的trainlm訓(xùn)練函數(shù)算法。經(jīng)多次試錯法訓(xùn)練，最佳隱含層神經(jīng)元個數(shù)為5個，訓(xùn)練后平均R值為0.997 43。

2.4 3種數(shù)學(xué)模型預(yù)測效果比較

對2019060401、2019060503其他2個批次13個試驗樣本進行發(fā)酵液黏度及還原糖含量檢測；依據(jù)發(fā)酵液黏度值利用一元線性回歸、二次項曲線回歸分析及BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)3種數(shù)據(jù)處理方法獲得數(shù)學(xué)模型對發(fā)酵液中還原糖含量進行估測；將實測值與模型估測值進行對比，試驗樣本方差作為3種模型的評價指標檢驗?zāi)Ｐ偷臏蚀_性，結(jié)果如表3所示。

表3 3種模型檢驗結(jié)果

由表3可知，利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的檢驗方差值最低，僅為0.169 4，算得標準差為0.411 5，表明利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立模型預(yù)測準確率較高，可用于發(fā)酵液中還原糖含量的快速估測，二次項曲線回歸分析模型與一元線性回歸模型的預(yù)測準確率較低。

3 結(jié)論

在透明質(zhì)酸發(fā)酵工業(yè)中，實時了解發(fā)酵液中還原糖含量，對掌握發(fā)酵過程狀況、判定發(fā)酵終止時間、提前準備后續(xù)分離純化工作有很大的指導(dǎo)意義。通過對發(fā)酵液中還原糖含量與透明質(zhì)酸、菌體量、濁度、黏度、電導(dǎo)率變化規(guī)律的相關(guān)及偏相關(guān)分析，發(fā)酵液黏度、透明質(zhì)酸含量、還原糖含量3個參數(shù)相關(guān)性顯著?？紤]到發(fā)酵液中透明質(zhì)酸檢測方法復(fù)雜、時間長、誤差大等缺點，選擇發(fā)酵液黏度作為估測發(fā)酵液中還原糖含量的唯一參數(shù)。對構(gòu)建一元線性回歸分析、二次項曲線回歸分析及BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)3種數(shù)據(jù)處理方法獲得的數(shù)學(xué)模型進行驗證分析，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測效果最為準確，方差為0.169 4，可以很好地預(yù)測發(fā)酵液中還原糖含量。由于試驗樣本有限，取33組試驗數(shù)據(jù)，如能增大試驗樣本數(shù)量，利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建模型對試驗結(jié)果預(yù)測會更加精確。此外，黏度與透明質(zhì)酸含量相關(guān)性非常顯著，利用黏度亦可預(yù)測發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量。