馬澤剛，楊新春, ，辛超，鐘輝云，吳秀麗，李嘉琴

1. 四川衛(wèi)生康復(fù)職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系（自貢 643000）；2. 自貢市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（自貢 643000）；3. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院（哈爾濱 150001）

絞股藍(lán)（Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino）系葫蘆科（Cucurbitaceae）絞股藍(lán)屬（Gynostemma）多年生草質(zhì)藤本植物[1]。絞股藍(lán)在《中藥大辭典》中名七葉膽，別名小苦藥、遍地生根、五葉參，日本名甘茶蔓等[2-4]。該屬植物基源復(fù)雜、品種繁多，我國(guó)有14種和3變種[5]，廣泛分布于陜西、四川、湖北、福建、云南等地。絞股藍(lán)中含有皂苷、多糖、黃酮類等化合物及鐵、鋅、銅、錳、硒等20多種微量元素[6]。絞股藍(lán)皂苷具有達(dá)瑪烷型的三萜骨架，與人參皂苷結(jié)構(gòu)類似，是目前唯一在五加科植物以外被發(fā)現(xiàn)含有人參皂苷類成分的植物[7]，故有“南方人參”“第二人參”的美譽(yù)[8-10]。迄今為止，從絞股藍(lán)分離和鑒定的化物中，共有8種皂苷為人參皂苷，分別為ginsenoside Rb1、Rb3、Rc、Rd、F2、Rg3、malonyl-Rd、Rf[7]。絞股藍(lán)皂苷是絞股藍(lán)的顯著藥效成分[11-12]，藥用效果與人參皂苷相似[13]，國(guó)內(nèi)外均有研究證明絞股藍(lán)皂苷具有明顯的抗腫瘤、降血脂、抗疲勞、保肝等作用[4]。

木糖醇又稱戊五糖，是一種帶有甜味的且具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的物質(zhì)，其形似綿白糖，極易溶于水，甜度相當(dāng)于蔗糖。精制的木糖醇可以食用，有清涼感，并為人體所吸收[14]。

木糖醇在體內(nèi)的代謝不會(huì)影響胰島素的分泌水平，故不會(huì)對(duì)血糖水平造成影響[15-16]，所以可用于糖尿病患者食品的生產(chǎn)。木糖醇的甜度約為山梨糖醇的2倍，甘露醇的3倍，因其甜度高、熱量低，可作為高級(jí)食糖替代物，有利于減肥人士控制熱量攝入[17-19]。

木糖醇的熱穩(wěn)定性較好，在食品加工時(shí)不會(huì)產(chǎn)生美拉德反應(yīng)。木糖醇還具有不能被絕大多數(shù)微生物利用、不易產(chǎn)生霉變等特點(diǎn)[20]。因此，木糖醇被廣泛應(yīng)用于口香糖、巧克力、飲料、糖果等制品中，其添加到飲料中還可改善飲料的風(fēng)味和品質(zhì)。

試驗(yàn)以陜西產(chǎn)絞股藍(lán)為主要原料，采用前期研究方法[21]提取絞股藍(lán)總皂苷，并以木糖醇為甜味劑，通過單因素及正交試驗(yàn)，確定絞股藍(lán)提取液、檸檬酸、木糖醇及食鹽的添加量，制備出一款色澤美觀、風(fēng)味獨(dú)特、適合糖尿病患者人群、具有一定保健功能的絞股藍(lán)飲料，為絞股藍(lán)飲料的開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

絞股藍(lán)藥材（采自陜西平利縣），經(jīng)四川衛(wèi)生康復(fù)職業(yè)學(xué)院副主任藥師鐘輝云鑒定為葫蘆科絞股藍(lán)屬植物絞股藍(lán)[Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino]；1, 1-二苯基-2-苦基肼（美國(guó)Sigma公司）；抑制與產(chǎn)生超氧陰離子測(cè)試盒、總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；木糖醇（食品級(jí)，浙江華康藥業(yè)股份有限公司）；無水檸檬酸（食品級(jí)，濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司）；乙醇等試劑（均為國(guó)產(chǎn)分析純，成都市科龍化工試劑廠）；純凈水（怡寶）。

1.2 儀器與設(shè)備

可見分光光度計(jì)（7200型，尤尼科儀器有限公司）；超聲清洗器（KQ5200B型，昆山市超聲儀器有限公司）；電子天平（AE240，瑞士Metter Toledo公司）；pH計(jì)（PHS-3C，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；手持糖度儀（ATAGO（愛拓）中國(guó)分公司）；自動(dòng)控制立式高壓蒸汽滅菌器（LDZX-75KBS，上海申安醫(yī)療器械廠）；電感耦合等離子發(fā)射光譜儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）。

1.3 工藝流程

絞股藍(lán)→粉碎→絞股藍(lán)總皂苷提取→過濾→調(diào)味（木糖醇、檸檬酸、食鹽）→精濾→滅菌→冷卻、灌裝→成品→檢驗(yàn)

1.4 工藝要點(diǎn)

1.4.1 絞股藍(lán)總皂苷的提取

根據(jù)前期研究成果，陜西產(chǎn)的絞股藍(lán)在總皂苷及4種重要人參皂苷Rb1、Rb3、Rc、Rd成分和含量上均較為占優(yōu)勢(shì)[21-22]，故以陜西產(chǎn)的絞股藍(lán)為原料。絞股藍(lán)總皂苷的最佳提取工藝為：60 ℃條件下，60%乙醇回流提取4次，每次2 h，料液比1∶10（g/mL）[21]。但乙醇作為溶劑提取的絞股藍(lán)在感官上較差，苦澀味濃重，無絞股藍(lán)特殊的香氣。在制備過程中乙醇會(huì)使成本增加，可能不適應(yīng)未來工業(yè)化生產(chǎn)。同時(shí)考慮到飲料在制備過程中的衛(wèi)生問題，故將提取溶劑乙醇改為水。

即稱取陜西產(chǎn)絞股藍(lán)，粉碎并過60目篩（孔徑0.25 mm），在60 ℃條件下，按照絞股藍(lán)與水質(zhì)量比1∶10，回流提取4次，每次2 h。合并濾液后并離心過濾，即得絞股藍(lán)總皂苷提取液。

1.4.2 飲料的調(diào)配

將制備好的絞股藍(lán)提取液與檸檬酸、木糖醇和食鹽進(jìn)行調(diào)配，通過單因素及正交試驗(yàn)，以感官評(píng)分作為標(biāo)準(zhǔn)，確定絞股藍(lán)飲料的最佳配方。

1.4.3 滅菌與灌裝

將調(diào)配好的飲料裝入滅菌器中，在100 ℃條件下滅菌10 min。冷卻至60 ℃后無菌灌裝。

1.5 單因素試驗(yàn)方法

以感官評(píng)分為評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，研究絞股藍(lán)提取液、木糖醇、食鹽及檸檬酸添加量對(duì)絞股藍(lán)飲料感官品質(zhì)的影響。

1.5.1 檸檬酸添加量的確定

固定絞股藍(lán)提取液添加量、木糖醇、食鹽添加量分別為30%，3%和0.1%，研究檸檬酸添加量（0.005%，0.010%，0.020%，0.040%和0.080%）對(duì)飲料感官評(píng)分的影響。

1.5.2 食鹽添加量的確定

固定絞股藍(lán)提取液添加量、木糖醇、檸檬酸添加量分別為30%，3%和0.01%，研究食鹽添加量（0.05%，0.08%，0.10%，0.12%和0.15%）對(duì)飲料感官評(píng)分的影響。

1.5.3 木糖醇添加量的確定

固定絞股藍(lán)提取液添加量、檸檬酸、食鹽添加量分別為30%，0.01%和0.1%，研究木糖醇添加量（1%，2%，3%，4%和5%）對(duì)飲料感官評(píng)分的影響。

1.5.4 絞股藍(lán)提取液添加量的確定

固定木糖醇、檸檬酸、食鹽添加量分別為3%，0.01%和0.1%，研究絞股藍(lán)提取液添加量（25%，30%，35%，40%和45%）對(duì)飲料感官評(píng)分的影響。

1.6 正交試驗(yàn)方法

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取絞股藍(lán)提取液添加量（A）、木糖醇添加量（B）、食鹽添加量（C）、檸檬酸添加量（D）為因素，以感官評(píng)分為指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì) %

1.7 感官評(píng)分

絞股藍(lán)飲料的配方評(píng)價(jià)采用感官綜合評(píng)分法，參考口服飲料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合飲料的實(shí)際特性，制定評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[23]，具體見表2所示。聘請(qǐng)具有飲料感官評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)的10名食品工作者，按照飲料的色澤、氣味、口感與組織形態(tài)進(jìn)行評(píng)分，在得分中去掉最高分和最低分后取平均值即為感官得分。

表2 絞股藍(lán)飲料的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.8 絞股藍(lán)飲料質(zhì)量指標(biāo)檢測(cè)方法

1.8.1 可溶性固形物的測(cè)定

用糖度儀測(cè)定。

1.8.2 pH的測(cè)定

用pH計(jì)測(cè)定。

1.8.3 穩(wěn)定性的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取制備好的飲料（m1）置于離心管中，在3 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min后，取離心后的上清液，稱質(zhì)量，記為m2，按照式（1）計(jì)算離心沉淀率，平行測(cè)定3次。離心沉淀率越大，表明溶液穩(wěn)定性越差[24]。

式中：m1為飲料的初始質(zhì)量，g；m2為飲料離心后的上清液質(zhì)量，g；w為離心沉淀率，%。

1.8.4 衛(wèi)生指標(biāo)的測(cè)定

由自貢市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科測(cè)定。

1.8.5 常見重金屬含量測(cè)定

由哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院測(cè)定。

1.9 抗氧化能力的測(cè)定

1.9.1 對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

用無水乙醇配置0.1 mmol/L的DPPH溶液，避光保存。在試管中分別加入2 mL待測(cè)液和2 mL的DPPH自由基溶液，充分振搖后置于暗處，在室溫下反應(yīng)30 min，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度。2 mL待測(cè)液加入等體積無水乙醇作為樣品對(duì)照，2 mL的DPPH自由基溶液加入等體積無水乙醇作為空白。測(cè)定時(shí)用無水乙醇調(diào)零，重復(fù)3次，取平均值，參照式（2）計(jì)算樣品的DPPH自由基清除率。

式中：A0為空白對(duì)照組吸光度；Ai為樣品組吸光度；Aj為陰性對(duì)照組吸光度。

1.9.2 對(duì)超氧陰離子清除能力的測(cè)定

采用南京建成試劑盒進(jìn)行測(cè)定，按照說明書操作如表3。

混勻，靜置10 min，用分光光度計(jì)測(cè)定各管吸光度，波長(zhǎng)550 nm，光徑1 cm，雙蒸水調(diào)零，按式（3）計(jì)算，得出抗超氧陰離子能力。

抗超氧陰離子能力（U/L）=（OD對(duì)照-OD測(cè)定）/（OD對(duì)照-OD標(biāo)準(zhǔn)）×標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（0.15 mg/mL）×

1.9.3 對(duì)ABTS自由基清除能力的測(cè)定

采用南京建成試劑盒進(jìn)行測(cè)定，按照說明書操作，如表4所示。

水浴完成后，分別在測(cè)定管中加入試劑四0.1 mL，對(duì)照管中加入試劑四0.1 mL和樣品0.1 mL。混勻，靜置10 min，用分光光度計(jì)測(cè)定各管吸光度，波長(zhǎng)520 nm，光徑1 cm，雙蒸水調(diào)零，按式（4）計(jì)算，得出抗ABTS自由基能力。

表3 超氧陰離子清除能力測(cè)定的操作說明 mL

表4 ABTS自由基清除能力測(cè)定操作說明 mL

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 檸檬酸添加量對(duì)絞股藍(lán)飲料的影響

檸檬酸添加量對(duì)絞股藍(lán)飲料的影響見圖1。

檸檬酸具有一定抗氧化作用[25]，適量的添加有助于增加飲料的酸味，并與糖搭配形成酸甜可口的風(fēng)味，對(duì)飲料的影響顯著。由圖1可知，檸檬酸添加量在0.005%～0.08%范圍內(nèi)對(duì)絞股藍(lán)飲料感官評(píng)分的影響表現(xiàn)出先增高后降低趨勢(shì)。檸檬酸添加量小于0.01%時(shí)，飲料的酸味明顯缺失，糖酸比例不協(xié)調(diào)，口感較差；檸檬酸添加量大于0.01%時(shí)，飲料的酸味漸漸加重，掩蓋飲料甜味，導(dǎo)致口感不適。故確定檸檬酸添加量為0.01%。

圖1 檸檬酸添加量對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)分的影響

2.1.2 食鹽添加量對(duì)飲料的影響

食鹽添加量對(duì)絞股藍(lán)飲料的影響見圖2。

飲料中加適量的食鹽更能突出甜味，改善風(fēng)味，同時(shí)也可以補(bǔ)充身體流失的鹽分。由圖2可知，在食鹽添加量0.05%～0.15%范圍內(nèi)對(duì)絞股藍(lán)飲料感官評(píng)分的影響表現(xiàn)出先緩慢增高后下降趨勢(shì)。食鹽添加量大于0.1%時(shí)，飲料偏咸，口感不適。故確定食鹽添加量為0.1%。

圖2 食鹽添加量對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)分的影響

2.1.3 木糖醇添加量對(duì)飲料的影響

木糖醇添加量對(duì)絞股藍(lán)飲料的影響見圖3。

飲料中添加木糖醇不僅有利于提高口感，并且不會(huì)影響血糖的變化。由圖3可知，在木糖醇添加量1%～5%范圍內(nèi)對(duì)絞股藍(lán)飲料感官評(píng)分的影響表現(xiàn)出先增高后降低趨勢(shì)。木糖醇加量小于3%時(shí)，飲料的甜味較淡，澀味較重；木糖醇添加量大于3%時(shí)，飲料的甜味漸漸加重，導(dǎo)致飲料偏甜，并且掩蓋絞股藍(lán)的特殊風(fēng)味。故確定木糖醇添加量為3%。

2.1.4 絞股藍(lán)提取液添加量對(duì)飲料的影響

絞股藍(lán)提取液添加量對(duì)絞股藍(lán)飲料的影響見圖4。

由圖4可知，在絞股藍(lán)提取液添加量25%～45%范圍內(nèi)，對(duì)絞股藍(lán)飲料感官評(píng)分的影響表現(xiàn)出先增高后降低趨勢(shì)。絞股藍(lán)提取液添加量小于30%時(shí)，飲料的絞股藍(lán)風(fēng)味缺失；絞股藍(lán)提取液添加量大于30%后，飲料的顏色加重，氣味增強(qiáng)，口感增添絞股藍(lán)特有苦味，導(dǎo)致飲料的感官評(píng)分呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。故確定絞股藍(lán)提取液添加量為30%。

圖3 木糖醇添加量對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)分的影響

圖4 絞股藍(lán)提取液添加量對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)分的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

絞股藍(lán)飲料正交試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析，影響因素的主次順序?yàn)椋篈＞D＞C＞B，即，絞股藍(lán)提取液添加量＞檸檬酸添加量＞食鹽添加量＞木糖醇添加量。通過對(duì)復(fù)合飲料的色澤、香氣、滋味及組織狀態(tài)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，9組內(nèi)感官評(píng)分最高為A1B2C2D2，而通過極差得出的最佳配方為A2B2C1D2，對(duì)兩者進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證試驗(yàn)，在A2B2C1D2工藝條件下，復(fù)合飲料的平均感官評(píng)分為89分，比A1B2C2D2結(jié)果差，因此確定絞股藍(lán)復(fù)合飲料的最佳配方為A1B2C2D2。即絞股藍(lán)提取液添加量30%、檸檬酸添加量0.02%、食鹽添加量0.08%、木糖醇添加量3%，此時(shí)感官評(píng)分最高為93分，制備的飲料不僅具有絞股藍(lán)特有風(fēng)味，并且酸甜可口，容易被接受。

2.3 絞股藍(lán)飲料質(zhì)量指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 主要理化指標(biāo)結(jié)果

絞股藍(lán)飲料主要理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見表6。

結(jié)果表明，制備的絞股藍(lán)飲料和滅菌后的飲料在可溶性固形物，pH和穩(wěn)定性方面均有一定變化，但影響不顯著。常見重金屬如鉛、鎘、汞和砷等重金屬均未在飲料中檢出。

表6 絞股藍(lán)飲料主要理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.3.2 衛(wèi)生指標(biāo)結(jié)果

經(jīng)檢測(cè)，絞股藍(lán)飲料（滅菌）的細(xì)菌總數(shù)≤100 CFU/mL、大腸桿菌≤3 CFU/mL，致病菌未檢出，符合GB 7101—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲料》要求。

2.4 絞股藍(lán)飲料的抗氧化活性

絞股藍(lán)飲料的抗氧化活性結(jié)果見表7。

抗氧化試驗(yàn)表明，絞股藍(lán)總皂苷提取液有較強(qiáng)的抗氧化能力，制備的絞股藍(lán)飲料對(duì)于DPPH自由基、超氧陰離子自由基及ABTS自由基均有一定清除能力，且在滅菌前后的變化不顯著，表明絞股藍(lán)飲料中的抗氧化活性成分未明顯受高溫滅菌的影響，工藝的滅菌條件可行。

表7 絞股藍(lán)飲料抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

采用單因素及正交試驗(yàn)確定絞股藍(lán)飲料的最佳配方：即絞股藍(lán)提取液添加量30%、檸檬酸添加量0.02%、食鹽添加量0.08%、木糖醇添加量3%。試驗(yàn)制備的絞股藍(lán)飲料，色澤美觀，不僅具有絞股藍(lán)獨(dú)特的風(fēng)味，而且還矯正絞股藍(lán)原有的苦澀感，口感酸甜適宜，并且不含任何防腐劑，符合GB 7101—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲料》質(zhì)量要求。

對(duì)于添加的木糖醇，不僅增加飲料甜度，也不會(huì)引起血糖變化，特別適合糖尿病患者飲用。滅菌后所制得的飲料成品，在可溶性固形物、pH、穩(wěn)定性及抗氧化活性方面與滅菌前都有一定變化，這可能是在高溫滅菌時(shí)對(duì)飲料中一些物質(zhì)造成影響，但差異不顯著。抗氧化活性結(jié)果發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)飲料對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基及ABTS自由基均有一定清除能力。試驗(yàn)結(jié)果為絞股藍(lán)在飲料方面的應(yīng)用提供理論和實(shí)踐參考，后續(xù)試驗(yàn)將對(duì)制備的飲料中具體皂苷類、多糖類物質(zhì)進(jìn)行定量分析。