趙妍，余從田，魏新林*

1. 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院（上海 200240）；2. 光明食品集團(tuán)（上海 200040）

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是根據(jù)天然除蟲菊酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性改造得到的一類仿生農(nóng)藥，具有殺蟲活性高、半衰期短、對哺乳動(dòng)物毒性低等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)和衛(wèi)生害蟲防治方面得到廣泛的應(yīng)用[1-3]。然而，有研究表明長期低劑量攝入擬除蟲菊酯對哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和遺傳物質(zhì)具有潛在的慢性毒性效應(yīng)[4-6]。因此，開發(fā)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥檢測方法對保障消費(fèi)者安全和健康具有重要意義。

目前，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的檢測方法主要有氣相色譜法[7]、高效液相色譜法[8]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9]、光譜分析法[10]和免疫分析法[11-12]等。然而，儀器分析方法存在操作復(fù)雜、成本高昂、專業(yè)要求高等問題，不能應(yīng)對靈活多變的檢測場景。相比較而言，酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）方法利用抗原抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)，靈敏度高、反應(yīng)時(shí)間短、不需要專業(yè)的操作手法，對檢測人員和檢測場地的要求不高。此外，如果使用廣譜抗體，能夠識(shí)別結(jié)構(gòu)相似的一類物質(zhì)，可以實(shí)現(xiàn)多殘留檢測，更加適合現(xiàn)場大量樣品的篩查。理論上，選擇合適的包被抗原與相應(yīng)的抗體匹配，可以提高間接競爭ELISA方法的靈敏度和檢測范圍。

此次試驗(yàn)從工作濃度、親和常數(shù)、靈敏度和交叉反應(yīng)等方面，考察不同方法制備的包被抗原與擬除蟲菊酯單克隆抗體的匹配程度，并從中選擇最佳包被抗原，然后對間接競爭ELISA的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終建立擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的多殘留酶聯(lián)免疫檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

擬除蟲菊酯標(biāo)準(zhǔn)品（德國DR.E公司）；擬除蟲菊酯單克隆抗體（無錫杰圣杰康生物）；3-苯氧基苯甲酸（PBA，日本TCI公司）；雞卵清蛋白（OVA）、Tween-20、明膠、3, 3’，5, 5’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（酶標(biāo)二抗）：北京索萊寶公司；其余試劑：國藥公司。

ELISA試驗(yàn)所用緩沖溶液參考陳燕妮[13]的配方。

1.2 方法

1.2.1 包被抗原的合成與鑒定

分別采用EDC法和混合酸酐法將PBA與OVA偶聯(lián)制備包被抗原[14]，反應(yīng)摩爾比（PBA∶OVA）為30∶1，45∶1和60∶1。將PBA、OVA和包被抗原分別進(jìn)行紫外波長掃描，波長范圍為200～400 nm。

1.2.2 包被抗原與抗體的親和常數(shù)測定

按照非競爭ELISA方法[15]測定各包被抗原與抗體的Ka。將抗原和抗體分別從1和10 μg/mL開始二倍比稀釋4個(gè)和8個(gè)濃度，兩兩交叉分布進(jìn)行測定，每組設(shè)置3次平行。親和常數(shù)（Ka）按式（1）[15]計(jì)算。

式中：n為每組數(shù)據(jù)中兩個(gè)包被抗原濃度的比值，大于1；[Ab′]t和[Ab]t分別為OD450nm降低1/2時(shí)對應(yīng)的抗體濃度，mol/L。

科技企業(yè)跨國并購創(chuàng)新績效影響研究回顧——基于距離的視角……………………………………………………………夏 赟，張 鵬，等（2）：96

1.2.3 間接競爭ELISA方法的操作過程

包被：添加包被抗原，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h，洗滌液洗滌3次，250 μL/孔（下同）。封閉：添加封閉液，100 μL/孔，37 ℃封閉2 h，洗滌。競爭反應(yīng)：先后添加適宜濃度的菊酯標(biāo)準(zhǔn)品和抗體，50 μL/孔，37 ℃孵育30 min，洗滌。酶標(biāo)二抗：稀釋3 000倍，100 μL/孔，37 ℃孵育30 min，洗滌。顯色：配制新鮮顯色液，100 μL/孔，37 ℃避光反應(yīng)15 min，然后加入50 μ L/孔終止液。測定：用酶標(biāo)儀測定OD450nm的值。

1.2.4 建立擬除蟲菊酯標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線

利用間接競爭ELISA方法測定不同質(zhì)量濃度擬除蟲菊酯的OD450nm值，檢測結(jié)果用Origin軟件進(jìn)行四參數(shù)Logistics函數(shù)擬合，繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，并計(jì)算抑制中濃度（IC50）。

1.2.5 擬除蟲菊酯的交叉反應(yīng)試驗(yàn)

按照1.2.4的方法分別測定其他擬除蟲菊酯的IC50值，根據(jù)式（2）計(jì)算11種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥以及半抗原與抗體的交叉反應(yīng)率（Cross-reactivity，CR）。

2 結(jié)果與分析

2.1 包被抗原的鑒定

根據(jù)擬除蟲菊酯的母核結(jié)構(gòu)選擇PBA（化學(xué)結(jié)構(gòu)見表3）作為包被半抗原。PBA、OVA和包被抗原的紫外掃描圖譜如圖1所示，PBA（291 nm）起到生色團(tuán)作用，導(dǎo)致包被抗原的特征吸收波長（288 nm）與OVA（277 nm）相比出現(xiàn)紅移現(xiàn)象，由此證明包被抗原偶聯(lián)成功。

2.2 包被抗原的篩選

2.2.1 包被抗原與抗體最佳工作濃度的測定

采用方陣滴定法[11]測定ELISA中包被抗原與抗體的最佳工作濃度。根據(jù)間接競爭ELISA檢測方法的要求，選擇OD450nm值在1.2～1.5之間且抗原、抗體用量較少的濃度，作為最佳工作濃度。經(jīng)過測定，抗體最佳工作濃度為0.25 μg/mL，包被抗原最佳工作濃度見表1。

2.2.2 包被抗原與抗體的親和常數(shù)測定

Ka反映抗原與抗體結(jié)合力的大小。一般認(rèn)為，當(dāng)Ka值在107～1012L/mol范圍時(shí)，抗體親和力較高[16]。根據(jù)式（1）計(jì)算得親和常數(shù)，見表1。6種包被抗原與抗體的親和常數(shù)均大于107L/mol，表明這些人工抗原與抗體的結(jié)合能力較高。此外，用混合酸酐法制備的包被抗原與抗體的親和力更高；并且在試驗(yàn)范圍（30∶1，45∶1和60∶1）內(nèi)，反應(yīng)比越大，親和力越高。結(jié)果如圖2所示。所選有機(jī)溶劑對抗原抗體的結(jié)合有顯著影響，根據(jù)體積分?jǐn)?shù)的不同，存在促進(jìn)或抑制結(jié)合不同的表現(xiàn)，其中甲醇的影響最小，與其他研究結(jié)果一致[11,17-18]，所以選擇甲醇作為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液中的輔助溶劑。

圖1 包被抗原紫外掃描圖譜

表2 交叉反應(yīng)篩選最佳包被抗原

表1 包被抗原的最佳工作濃度與親和常數(shù)

2.2.3 交叉反應(yīng)篩選最佳包被抗原

表2匯總了利用間接競爭ELISA方法初步測定11種擬除蟲菊酯的交叉反應(yīng)結(jié)果，使用MA2包被時(shí)能夠識(shí)別8種擬除蟲菊酯，在所有包被抗原中數(shù)量最多且靈敏度最高。

綜合比較包被抗原的工作濃度、親和常數(shù)、交叉反應(yīng)和靈敏度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)方法和反應(yīng)比對各指標(biāo)有顯著影響。與EDC法相比，混合酸酐法制備的包被抗原用量少、與抗體結(jié)合能力更強(qiáng)，對擬除蟲菊酯的交叉反應(yīng)更多，且靈敏度更高，而不同反應(yīng)比得到的包被抗原指標(biāo)也有差別。最終選擇MA2（混合酸酐法，反應(yīng)比45∶1）作為最佳包被抗原進(jìn)行進(jìn)一步的方法建立。

2.3 間接競爭ELISA方法的條件優(yōu)化

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液中有機(jī)溶劑種類及濃度的優(yōu)化

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在水中溶解度極小，但易溶于有機(jī)溶劑，所以需要選擇適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑輔助溶解。用不同有機(jī)溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，不添加菊酯標(biāo)準(zhǔn)品，考察常見有機(jī)溶劑對抗原抗體結(jié)合能力的影響，

圖2 有機(jī)溶劑對抗原抗體結(jié)合能力的影響

圖3 甲醇體積分?jǐn)?shù)對間接競爭ELISA的影響

甲醇含量的影響如圖3所示。中低體積分?jǐn)?shù)（10%～40%）甲醇對抑制曲線和靈敏度的影響較小，高體積分?jǐn)?shù)（50%～60%）甲醇會(huì)降低菊酯的抑制效果。這可能是一定體積分?jǐn)?shù)的甲醇促進(jìn)了菊酯的溶解和分散，過多的甲醇則破壞了抗體的蛋白結(jié)構(gòu)，影響其與抗原的結(jié)合[11]?？紤]到盡可能減少對反應(yīng)體系的影響，甲醇添加量選擇10%。

2.3.2 抗體稀釋液中離子強(qiáng)度的優(yōu)化

抗原-抗體的結(jié)合反應(yīng)與二者作用時(shí)形成的鹽橋和氫鍵有關(guān)，離子強(qiáng)度（即緩沖液中鹽離子濃度）是一個(gè)重要的影響因素。離子強(qiáng)度對間接競爭ELISA的影響如圖4所示。當(dāng)離子強(qiáng)度大于或等于20 mmol/L時(shí)，抗原與抗體之間沒有結(jié)合反應(yīng)；當(dāng)離子強(qiáng)度為5 mmol/L時(shí)，IC50急劇增大，靈敏度降低；而當(dāng)離子強(qiáng)度為10 mmol/L時(shí)，抑制曲線的趨勢正常，且靈敏度較高。因此，抗體稀釋液的離子強(qiáng)度選擇10 mmol/L。

圖4 離子強(qiáng)度對間接競爭ELISA的影響

2.3.3 抗體稀釋液pH的優(yōu)化

pH是影響抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的另一個(gè)重要因素，pH對間接競爭ELISA的影響如圖5所示。不同pH條件下ODmax的差異較大，表明pH對抗原抗體結(jié)合能力具有較大的影響；而ODmin的差異較小，表明在pH 6.0～9.5范圍內(nèi)，菊酯的抑制效果相似。綜合考慮兩者的影響，選擇對抗原抗體結(jié)合作用影響最小的pH，即pH 7.4作為抗體稀釋液的pH。

圖5 pH對間接競爭ELISA的影響

2.4 甲氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線

在優(yōu)化條件下建立間接競爭ELISA檢測甲氰菊酯的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，如圖6所示。其IC50為8.69 ng/mL，線性檢測范圍（IC20～I(xiàn)C80）為2.65～28.55 ng/mL，檢測限（IC10）為1.32 ng/mL。

2.5 間接競爭ELISA對擬除蟲菊酯交叉反應(yīng)率的測定

11種擬除蟲菊酯以及半抗原的交叉反應(yīng)結(jié)果如表3所示。建立的間接競爭ELISA方法對甲氰菊酯的靈敏度最高，對氯氰菊酯、苯醚氰菊酯、氟氯氰菊酯具有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)（CR＞10%），對高效氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氟氯苯菊酯和順式氰戊菊酯具有中等強(qiáng)度的交叉反應(yīng)（1%＜CR＜10%），對氯菊酯、右旋苯醚菊酯、聯(lián)苯菊酯和PBA無交叉反應(yīng)。

圖6 間接競爭ELISA檢測甲氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線

表3 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的交叉反應(yīng)結(jié)果

3 結(jié)論

用EDC法和混合酸酐法按不同反應(yīng)比合成包被抗原，通過工作濃度、親和常數(shù)、交叉反應(yīng)和靈敏度等指標(biāo)，篩選出以混合酸酐法制備，反應(yīng)摩爾比45∶1的MA2為最佳包被抗原，用于檢測方法的建立。經(jīng)過間接競爭ELISA試驗(yàn)條件的優(yōu)化，選擇離子強(qiáng)度10 mmol/L、pH 7.4、甲醇含量10%作為競爭反應(yīng)的最佳條件。在此基礎(chǔ)上，建立了甲氰菊酯的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，并測定11種擬除蟲菊酯及半抗原的交叉反應(yīng)。結(jié)果顯示，該方法能同時(shí)檢測8種擬除蟲菊酯，靈敏度達(dá)8.69～344.97 ng/mL，能夠?qū)崿F(xiàn)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的多殘留檢測。該方法還需要針對實(shí)際樣品進(jìn)行進(jìn)一步的準(zhǔn)確性評價(jià)。