王軍喜，何一龍，劉曉艷*，白衛(wèi)東，錢敏，趙文紅

1. 廣東粵師傅調(diào)味食品有限公司（開平 529341）；2. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院（廣州 510225）

氨基甲酸乙酯（EC），又名尿烷。20世紀(jì)70年代，由外國學(xué)者在發(fā)酵食品中首次發(fā)現(xiàn)[1]，是食品在發(fā)酵和儲藏過程中產(chǎn)生的天然副產(chǎn)物，廣泛存在于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中（包括面包、酸牛奶、葡萄酒、豆豉、黃酒、釀造醬油和食醋等）[2-3]。EC于2007年被世界衛(wèi)生組織（WHO）認(rèn)定為“2A”級致癌物[4]。EC具有口服毒性，但急性低，麻醉小型嚙齒類動物的單次劑量需達(dá)到1 000 mg/kg mb以上；研究發(fā)現(xiàn)，長期攝入EC會導(dǎo)致試驗(yàn)小鼠體質(zhì)量和存活率下降及腫瘤的發(fā)生。人體攝入EC質(zhì)量濃度超過30 μg/L后，患癌概率增加，可導(dǎo)致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮膚癌等疾病[5-6]。

醬油作為一種區(qū)域性強(qiáng)的發(fā)酵型調(diào)味品，在亞洲國家生產(chǎn)和食用量較大。醬油中的精氨酸、瓜氨酸含量非常豐富，且在發(fā)酵過程中會有一定濃度的尿素及乙醇產(chǎn)生。EC可由尿素、瓜氨酸和乙醇自發(fā)反應(yīng)生成[7-8]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄酒釀造的酒精發(fā)酵后期，精氨酸代謝產(chǎn)生的瓜氨酸、尿素等物質(zhì)會與乙醇發(fā)生緩慢的化學(xué)反應(yīng)生成EC，但以尿素為主[9]。在黃酒的研究中同樣認(rèn)為EC是乙醇與尿素反應(yīng)生成為主[10]。醬油中EC的主要前體物質(zhì)被認(rèn)為與瓜氨酸關(guān)系較大[11]。醬油的釀造時間長，也為EC的形成提供了條件。然而，目前我國尚未制定發(fā)酵食品和酒精飲料中EC的限量標(biāo)準(zhǔn)，也未引起足夠重視。在非酒類食品中，醬油中EC含量要顯著高于其他食品[12-13]，國內(nèi)對于醬油中EC的研究較少，且安全問題未進(jìn)行合理評估。隨著醬油消費(fèi)量日漸增加，分析我國醬油中EC含量水平，評估廣東傳統(tǒng)釀造醬油中EC的現(xiàn)狀勢在必行。試驗(yàn)利用固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（SPE-GC/MS）法對市售35種廣式傳統(tǒng)釀造高鹽稀態(tài)醬油中的EC進(jìn)行調(diào)查分析，試驗(yàn)結(jié)果為醬油的安全生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬油樣品（市售）。

EC標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%，美國Sigma公司）；氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品、D5-氨基甲酸乙酯（nPC，純度≥98.5%，德國Dr. Ehrenstorfer公司）；甲醇（色譜純）、二氯甲烷（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-MS（6890-5973i，美國安捷倫公司）；INNONWAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μ m，美國安捷倫公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52c，鞏義市予華儀器公司）；氮吹儀（MD200-1，江蘇盛藍(lán)儀器制造有限公司）；恒溫磁力攪拌器（78HW-1，金壇市國旺實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

參照GB 5009.223—2014方法稍有改動。準(zhǔn)確稱取2 g醬油樣品于10 mL具塞試管中，加入100 μL 2 μg/mL的D5-氨基甲酸乙酯溶液，超聲使其溶解，混勻后真空條件下將樣液緩緩倒入堿性硅藻土固相萃取小柱并靜置10 min。經(jīng)適量正己烷淋洗后，用適量5%乙酸乙酯-乙醚溶液以流速1 mL/min進(jìn)行洗脫，洗脫液經(jīng)裝有適量無水硫酸鈉的漏斗脫水后，收集到10 mL刻度試管中，室溫下氮?dú)獯抵良s0.5 mL，用甲醇定容至1.00 mL，上機(jī)檢測。

1.3.2 GC-MS色譜條件

色譜柱：HP-INNOWAX 30 m×0.25 mm（內(nèi)徑）×0.2 μm（膜厚）；進(jìn)樣口溫度220 ℃；SIM模式掃描；進(jìn)樣量1 μL；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；流速1.2 mL/min；不分流；升溫程序：初始溫度50 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升至180 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升至240 ℃，保持5 min。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

結(jié)合唐雙雙等[14]和崔海灝等[15]的方法，稍作改動。準(zhǔn)確稱取氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容至0.5 μg/mL，同樣方法稱取D5-氨基甲酸乙酯（D5-Ethyl carbamate）標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇定容至2 μg/mL；分別準(zhǔn)確吸取氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.5 μ g/mL）于容量瓶中定容，得到質(zhì)量濃度為10，25，50，100和200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，準(zhǔn)確吸取100 μL 2 μg/mL D5-氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)液，分別加入到各濃度標(biāo)準(zhǔn)中間液，得到標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.4 結(jié)果分析

數(shù)據(jù)均使用SPSS Statistic 17.0軟件進(jìn)行分析，采用Origin 8.6軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 EC的檢測方法

以固相萃取法萃取醬油中EC，參考文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)EC蒸汽壓較高，易升華，外標(biāo)法定量回收率低，目標(biāo)物損失較大，故試驗(yàn)采用內(nèi)標(biāo)法定量檢測，以D5-氨基甲酸乙酯作為內(nèi)標(biāo)物，用GC-MS定量分析[16]。以離子色譜峰面積與其對應(yīng)濃度作線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.305 063x+0.025 213（R2=0.999 4），線性結(jié)果較好。

2.2 醬油中EC的含量調(diào)查

從廣州各市區(qū)隨機(jī)購得35個醬油樣品，均為廣東本地品牌且被生產(chǎn)企業(yè)標(biāo)注為釀造醬油，所用的工藝均為高鹽稀態(tài)工藝（GB/T 18186）。

檢測35個市售高鹽稀態(tài)醬油樣品中氨基甲酸乙酯含量，結(jié)果如表1所示。被調(diào)查樣品來自7個不同品牌，Z牌、W牌、R牌、L牌、H牌、D牌和C牌分別占樣品總數(shù)的20.0%，14.3%，11.4%，14.3%，28.6%，2.9%和8.8%。其中特級、一級、二級和三級醬油（氨基酸態(tài)氮不低于0.8，0.7，0.55和0.4 g/mL）分別占全部樣品的40%，17.1%，14.3%和28.6%。在調(diào)查樣品中均有檢出EC，其范圍為2.9～104.2 μg/kg，平均值為16.9 μg/kg，中位值為11.2 μg/kg；與王立媛等[17]調(diào)查浙江市售醬油中EC含量1.6～80.8 μg/kg有所差異；試驗(yàn)調(diào)查樣品主要集中在廣州市售高鹽稀態(tài)醬油，由于地域差異，醬油的釀曬工藝存在不同，導(dǎo)致兩地醬油中EC含量也存在差異，EC含量略高于浙江。

表1 市售醬油中EC含量的調(diào)查

2.3 醬油中EC含量的統(tǒng)計(jì)分析

2.3.1 不同品牌醬油中EC含量次數(shù)分布統(tǒng)計(jì)分析

不同品牌醬油中EC的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，詳見表2和表3。EC含量高于100 μg/kg有1個，占2.9%；EC含量在50～100 μg/kg之間的有2個，占5.7%；EC含量在20～50 μg/kg之間有3個，占8.6%；EC含量在10～20 μg/kg之間有13個，占37.1%；EC含量在10 μg/L以下的16個，占45.7%。被調(diào)查醬油中EC含量主要在0～20 μg/kg之間，占總樣品的82.9%，結(jié)果表明廣州市售醬油大部分安全。在7個品牌中，EC含量平均值最大的為C品牌，達(dá)到41.2 μg/kg，其次是H品牌（23.3 μg/kg）；平均值最小的為R牌（7.0 μg/kg）；EC含量中間值最大的是H牌，為16.0 μg/kg，最小的為R牌（5.5 μg/kg）；EC含量最大值最高的是C牌（104.2 μg/kg），其次是H牌（72.8 μg/kg）；R牌最小值為2.9 μg/kg，是所有品牌中最小值最小的。

表2 醬油中氨基甲酸乙酯含量的次數(shù)分布表（n=35）

表3 不同廠家醬油中EC含量描述性統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3.2 不同等級醬油中EC含量的統(tǒng)計(jì)分析

由圖1可以看出，一級醬油中EC含量主要在0～10 μg/kg之間；二級、三級主要在0～20 μg/kg之間；特級醬油各區(qū)間均含有EC檢出（0～10，10～20，20～50及50 μg/kg分別占11.4%，14.3%，5.7%和8.6%）；不同等級醬油中EC含量差異較大，部分特級醬油中EC含量偏高，但總體明顯高于其他等級的醬油；這可能與特級醬油中氨基酸態(tài)氮含量高于一級、二級和三級有關(guān)，氨基酸態(tài)氮含量越高，醬油中游離氨基酸越多，前體物精氨酸、瓜氨酸含量越高，EC更容易形成。二級、三級醬油經(jīng)過二次三次淋油，其具有更多時間進(jìn)行乙醇發(fā)酵和尿素生成，所以二級、三級醬油中EC含量略高于一級醬油。

圖1 不同等級醬油中氨基甲酸乙酯（EC）含量對比

3 結(jié)論與討論

通過SPE-GC/MS法對廣東35個醬油樣品中EC含量進(jìn)行檢測調(diào)查，結(jié)果表明，EC含量高于100 μg/kg有1個，在50～100 μg/kg之間有2個，在20～50 μg/kg之間有3個，在10～20 μg/kg之間有13個，在10 μg/L以下有16個，分別占總數(shù)的2.9%，5.7%，8.6%，37.1%和45.7%；EC含量主要在0～20 μg/kg之間，占總樣品的82.9%，說明廣州市售醬油大部分是安全的。但EC含量高于20 μg/kg的占17.1%，且有一個樣品的EC含量高于100 μg/kg，醬油中的EC問題也不容忽視。特級醬油中EC含量明顯高于其它等級，各品牌EC含量差異明顯，這可能與其釀造工藝有關(guān)；釀造醬油都要經(jīng)過選料、蒸煮、制曲、釀曬、滅菌、沉淀、調(diào)味等加工工序[18]，除選料、蒸煮和沉淀以外，制曲、釀曬、滅菌工藝根據(jù)各自特色有所差異；不同品牌、發(fā)酵時間、滅菌工藝及調(diào)配工藝不同會導(dǎo)致產(chǎn)品EC含量不同。