楊佳麗，荊志懷，張星，王如福

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（晉中 030801）

蘋(píng)果（Malus domesicaBorkh.）營(yíng)養(yǎng)豐富，兼具食用、藥用價(jià)值，產(chǎn)銷需求旺盛，是我國(guó)傳統(tǒng)的大宗水果之一[1]。蘋(píng)果屬呼吸躍變型果實(shí)，在采后貯運(yùn)期間易被病原菌侵染，尤其是由擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病會(huì)造成果實(shí)發(fā)生大范圍的腐爛[2]。目前，化學(xué)殺菌劑依然是控制采后真菌病害最行之有效的方法，但其頻繁使用會(huì)對(duì)環(huán)境和食品安全產(chǎn)生較大的危害。利用誘導(dǎo)因子激活果實(shí)內(nèi)在的抗性機(jī)制已成為當(dāng)前果蔬采后病害防治中的研究熱點(diǎn)[3]。

L-谷氨酸是植物體內(nèi)一種非常重要的氨基酸，不僅參與多種氨基酸的合成，且調(diào)節(jié)著一些重要的生理代謝過(guò)程，尤其是以其為前體物質(zhì)的代謝產(chǎn)物（如γ-氨基丁酸、精氨酸、脯氨酸），與植物的抗逆境脅迫密切相關(guān)[4]。已有研究顯示，L-谷氨酸在植物響應(yīng)外界非生物脅迫時(shí)可能發(fā)揮重要作用[5]。然而目前有關(guān)L-谷氨酸在植物與病原菌互作中的作用還鮮有報(bào)道。近年來(lái)，有研究提出L-谷氨酸代謝參與了植物的防御反應(yīng)，同時(shí)其參與方式可能與病原菌的種類有關(guān)[6]。前期的研究中也首次明確了L-谷氨酸可作為一種理想的化學(xué)誘導(dǎo)因子激發(fā)番茄果實(shí)對(duì)黑斑病產(chǎn)生抗性，且其抗性機(jī)制可能與碳氮代謝有關(guān)[7]。為進(jìn)一步揭示L-谷氨酸的誘抗機(jī)制、擴(kuò)大其適用范圍，以蘋(píng)果果實(shí)為研究對(duì)象，探討L-谷氨酸對(duì)果實(shí)青霉病的抑制效果以及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用的紅富士蘋(píng)果（Malus domesicaBorkh. cv.Fuji）產(chǎn)地為山西運(yùn)城，購(gòu)于山西晉中當(dāng)?shù)氐乃l(fā)市場(chǎng)。挑選大小均勻、無(wú)機(jī)械損傷、成熟度一致的果實(shí)進(jìn)行試驗(yàn)；Penicillium expansum為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

L-谷氨酸，分析純，購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，使用前將其pH調(diào)至7左右，并用0.45 μ m濾膜處理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 孢子懸浮液的制備

Penicillium expansum在PDA培養(yǎng)基中28 ℃條件下培養(yǎng)7 d，利用無(wú)菌水將病原菌孢子洗出，隨即利用血球計(jì)數(shù)板將孢子懸浮液調(diào)整至所需濃度，備用。

1.2.2 原料處理及取樣

前期研究顯示0.1 g·L-1L-谷氨酸可有效抑制青霉病病害的發(fā)生，此次試驗(yàn)選用此濃度開(kāi)展后續(xù)研究。在果實(shí)表面赤道位置用滅菌打孔器制造2個(gè)大小深度一致的孔（直徑約5 mm，深度約2 mm），分別注入30 μ L的無(wú)菌水和0.1 g·L-1L-谷氨酸溶液。在恒溫、恒濕條件下（25 ℃，相對(duì)濕度約95%）誘導(dǎo)處理24 h，然后向每個(gè)孔接入20 μL的青霉菌孢子懸浮液（104spores·mL-1），并用保鮮膜密封置于恒溫恒濕箱中。貯藏期間每天定時(shí)觀察果實(shí)的發(fā)病情況，同時(shí)取病斑周圍的果肉組織，立即用液氮凍存，置于-80℃下備用。每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)至少9個(gè)果實(shí)，整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.3 項(xiàng)目測(cè)定

1.3.1 發(fā)病率和病斑直徑的測(cè)定

發(fā)病率按式（1）計(jì)算。病斑直徑用十字交叉法取平均值。

發(fā)病率=發(fā)病果實(shí)/總果實(shí)數(shù)×100% （1）

1.3.2 抗氧化酶活性和丙二醛含量的測(cè)定

過(guò)氧化物酶（Peroxldase，POD）活性測(cè)定參照Lurie等[8]的愈創(chuàng)木酚法；過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）活性測(cè)定依據(jù)Aebi等[9]的方法；超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）利用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量參照余辰[10]的方法測(cè)定。

1.3.3L-脯氨酸和草酸含量的測(cè)定

L-脯氨酸和草酸含量利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS技術(shù)）分析測(cè)定。樣品的提取和衍生化處理參照Pedreschi等[11]的方法進(jìn)行。

GC-MS反應(yīng)條件：采用TR-5色譜柱（30 m×0.25 mm內(nèi)徑，0.25 μm膜厚）；載氣，氦氣（流速1.0 mL·min-1）；升溫程序，柱溫70 ℃保留2 min，以10 ℃·min-1升高至220 ℃，最后以20 ℃·min-1上升到260 ℃保留3 min；分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL，流速5 mL·min-1，分流比5∶1；電離方式，電子轟擊離子源（EI），電子能量70 eV；傳輸線溫度，240 ℃；全譜掃描質(zhì)量范圍，m/z50～650。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS/PC ver. II.x軟件進(jìn)行Duncan’s差異分析，p＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源L-谷氨酸對(duì)蘋(píng)果青霉病的影響

如圖1所示，隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，果實(shí)的發(fā)病率和病斑直徑逐漸上升。在圖1（A）中，蘋(píng)果在接種3 d 后，對(duì)照組發(fā)病率達(dá)到48.1%，而L-谷氨酸處理組僅為27.8%；在接種第4天時(shí)，相對(duì)于對(duì)照組，處理組發(fā)病率下降了27.8%。與發(fā)病率類似，L-谷氨酸處理組的病斑直徑也顯著低于對(duì)照組（圖1B），尤其是在第3天時(shí)，處理組降低了約44.9%?？梢?jiàn)L-谷氨酸對(duì)蘋(píng)果青霉病有較好的抑制效果。

圖1 L-谷氨酸對(duì)蘋(píng)果青霉病的影響

2.2 外源L-谷氨酸對(duì)丙二醛含量的影響

當(dāng)植物體內(nèi)的活性氧大量積累時(shí)會(huì)誘發(fā)膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的增加。如圖2所示，果實(shí)自被侵染24 h后，MDA含量呈逐步上升趨勢(shì)，且處理組在侵染過(guò)程中低于對(duì)照組，尤其是在72 h時(shí)，對(duì)照組為處理組的1.37倍。

2.3 外源L-谷氨酸對(duì)果實(shí)抗氧化酶活性的影響

植物在長(zhǎng)期進(jìn)化中形成了應(yīng)對(duì)外界環(huán)境脅迫時(shí)產(chǎn)生的自我防御系統(tǒng)，如抗氧化酶系統(tǒng)。如圖3（A）所示，POD活性整體呈先升后降的趨勢(shì)，在接種病原菌后的前24 h，L-谷氨酸處理組明顯高于對(duì)照組，具體來(lái)說(shuō)在0 h和24 h時(shí)，POD活性分別為對(duì)照組的1.46倍和1.21倍。同時(shí)圖3（B）中的結(jié)果顯示，經(jīng)L-谷氨酸處理后的果實(shí)在被病原菌侵染前期，CAT活性迅速上升，而后雖趨于平緩，但在整個(gè)侵染過(guò)程中依然高于對(duì)照組，尤其在24 h達(dá)到峰值時(shí)，約為對(duì)照組的2.11倍。SOD活性在處理期間的變化趨勢(shì)與上述POD和CAT類似，可被L-谷氨酸快速誘導(dǎo)提高（圖3C）。

圖2 L-谷氨酸對(duì)MDA含量的影響

圖3 L-谷氨酸對(duì)抗氧化酶活性的影響

2.4 外源L-谷氨酸對(duì)L-脯氨酸和草酸含量的影響

已有文獻(xiàn)報(bào)道，L-脯氨酸和草酸可作為有效的抗氧化劑，可清除活性氧。GC-MS分析結(jié)果顯示，在病原菌侵染早期（24 h），蘋(píng)果經(jīng)外源L-谷氨酸處理，其體內(nèi)的脯氨酸含量與對(duì)照組并無(wú)差異，隨著病害的進(jìn)一步發(fā)展，達(dá)到72 h時(shí)，L-谷氨酸約為對(duì)照組的1.43倍（圖4A）。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，L-谷氨酸對(duì)果實(shí)中草酸的含量也會(huì)產(chǎn)生一定的影響，如圖4（B）所示，相比于對(duì)照組，L-谷氨酸處理組中的草酸含量顯著增加，尤其是在72 h時(shí)，草酸含量提高了26.9%。

圖4 L-谷氨酸對(duì)L-脯氨酸和草酸的影響

3 討論與結(jié)論

在前期研究中已初步證實(shí)L-谷氨酸可作為一種激發(fā)因子，有效抑制由Alternaria alternata引起的番茄黑斑病[7]。在此次試驗(yàn)中，蘋(píng)果果實(shí)經(jīng)0.1 g·L-1L-谷氨酸誘導(dǎo)處理，可以顯著降低青霉病的發(fā)病率和病斑直徑，抵御病原菌P.expansum的侵染，這與L-谷氨酸對(duì)A.alternata的作用規(guī)律一致。P.expansum是典型的腐生型病原菌，其營(yíng)養(yǎng)獲取主要是來(lái)自死亡的宿主細(xì)胞或組織。當(dāng)植物被病原菌侵染時(shí)，其體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，從而誘發(fā)膜脂過(guò)氧化和膜透性喪失，最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞受到傷害甚至死亡，也就是說(shuō)活性氧在果實(shí)體內(nèi)的大量積累非常利于腐生型病原菌的侵染[11]。然而植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化中形成了一套完善有效的活性氧清除系統(tǒng)保護(hù)機(jī)體免受傷害，如抗氧化酶系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，SOD可催化超氧陰離子自由基，歧化生成O2和H2O2，POD和CAT等抗氧化酶可將活性氧H2O2分解為O2和H2O，從而抑制過(guò)量活性氧的積累，減弱膜脂過(guò)氧化造成的細(xì)胞膜系統(tǒng)損傷，其中MDA可作為衡量膜脂過(guò)氧化程度的一個(gè)重要指標(biāo)[12]。此次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蘋(píng)果在被P.expansum侵染時(shí)，L-谷氨酸會(huì)迅速誘導(dǎo)果實(shí)抗氧化酶POD，CAT和SOD活性的提高，并能有效抑制MDA的積累。這與Yang等[13]的研究結(jié)果類似，番茄果實(shí)經(jīng)外源GABA處理后增強(qiáng)對(duì)A.alternata的抗性，可能與提高抗氧化酶活性有關(guān)。也就是說(shuō)，L-谷氨酸可能是通過(guò)激活果實(shí)體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，阻止過(guò)量活性氧產(chǎn)生和膜脂過(guò)氧化。

近年來(lái)的研究表明，植物體內(nèi)積累的活性氧還可以通過(guò)抗氧化劑來(lái)清除，如脯氨酸和草酸[14]。草酸是廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的一種代謝產(chǎn)物，可通過(guò)與金屬離子螯合劑發(fā)生Fenton反應(yīng)來(lái)影響機(jī)體內(nèi)的活性氧代謝[15]。目前，草酸已作為天然的抗氧化劑，被廣泛應(yīng)用于果蔬保鮮領(lǐng)域。有研究發(fā)現(xiàn)，桃果實(shí)在被草酸處理后，果肉中的H2O2和超氧化物自由基含量會(huì)明顯降低[16]。脯氨酸作為蛋白氨基酸之一，可在吡咯琳-5-羧酸合成酶（P5CS）和吡咯琳-5-羧酸還原酶（P5CR）的催化下由L-谷氨酸作為底物直接合成。脯氨酸在參與響應(yīng)植物逆境脅迫中占據(jù)重要地位，尤其是在抗?jié)B透脅迫中，可作為一種惰性的相容性滲透物質(zhì)，來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)和液泡間的滲透壓平衡[17]。同時(shí)，有研究報(bào)道脯氨酸還可以作為一種有效的抗氧化劑清除活性氧，通過(guò)與抗氧化酶系統(tǒng)協(xié)同作用調(diào)控機(jī)體內(nèi)活性氧的平衡[18]。此次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蘋(píng)果在遭受病原菌的侵染時(shí)，L-谷氨酸處理會(huì)提高果實(shí)體內(nèi)抗氧化劑草酸和脯氨酸的含量，這可能會(huì)抑制活性氧的大量生成，從而給予果實(shí)對(duì)P.expansum產(chǎn)生更強(qiáng)的抗性。

L-谷氨酸作為化學(xué)誘導(dǎo)因子，因其生產(chǎn)貯藏成本低，容易獲得且安全環(huán)保，在果蔬采后病害領(lǐng)域內(nèi)具有廣闊的商業(yè)應(yīng)用前景。通過(guò)研究L-谷氨酸對(duì)蘋(píng)果抗氧化能力的影響發(fā)現(xiàn)，其對(duì)腐生型病原菌P.expansum的抗性機(jī)制可能與抗氧化酶系統(tǒng)的激活和某些抗氧化劑（如L-脯氨酸和草酸）的積累有關(guān)，從而阻止活性氧對(duì)宿主細(xì)胞的傷害，這將為L(zhǎng)-谷氨酸作為新型化學(xué)誘導(dǎo)劑的商業(yè)化提供一定的理論依據(jù)。