苗欣宇，李達(dá)，鄭麗，遲燕平，王景會，牛紅紅

吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品加工研究所（長春 130033）

納豆是以大豆為原料，經(jīng)過納豆芽孢桿菌（B.subtilis natto）發(fā)酵而成的傳統(tǒng)食品。發(fā)酵可以提高食品的營養(yǎng)價值和感官性能[1]。納豆芽孢桿菌在發(fā)酵大豆的過程中不僅能分解大豆中的大分子物質(zhì)，如碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪等，使發(fā)酵產(chǎn)品中擁有豐富的有機酸、氨基酸、寡糖等易被人體吸收的小分子化合物[2]；還能在發(fā)酵時產(chǎn)生對人類有利的代謝產(chǎn)物，如具有溶血栓、改善血液循環(huán)的納豆激酶（NK）[3]。納豆芽孢桿菌本身具有抑制腸道中致病菌的生長繁殖、減少致病菌定植的作用，同時大豆異黃酮也具有許多生理學(xué)特性[4]，因此，納豆富含多種活性物質(zhì)，具有預(yù)防疾病和保健功能，備受國內(nèi)外研究人員關(guān)注。

納豆在生產(chǎn)以及貨架冷藏期間活性物質(zhì)會發(fā)生變化，從而影響其功效。甄珍[5]對5種風(fēng)味納豆中的7種活性成分在貨架期內(nèi)的變化進(jìn)行跟蹤測定，研究發(fā)現(xiàn)在貨架期內(nèi)7種活性成分有不同程度的顯著性變化，其中脂肪酶活性相對穩(wěn)定，而淀粉酶活性變化最大，結(jié)果表明7 d內(nèi)納豆可保持較高活性成分。張樹明等[6]探討黃豆、黑豆混合后發(fā)酵與發(fā)酵后混合納豆中異黃酮含量的差異及最佳配比，認(rèn)為黃豆、黑豆混合后發(fā)酵優(yōu)于發(fā)酵后混合，并以1∶3配比時納豆中染料木素及大豆苷元含量具有優(yōu)勢。

納豆活性成分豐富，但是關(guān)于納豆在貨架期活性成分變化的研究較少。因此，試驗采用3種不同小粒豆作為發(fā)酵原料，以前期試驗中篩選的活力較好的納豆芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵[7]，對貨架期內(nèi)納豆基本理化成分、NK活性及異黃酮等成分變化進(jìn)行測定，探討納豆的最佳食用時間，以期更好發(fā)揮納豆保健功效，為納豆生產(chǎn)加工、貨架期保藏和消費提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與材料

納豆芽孢菌（JLGZL-018，吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所食品微生物團(tuán)隊保藏）；3種小粒豆（市售，編號為103號、2號和8號）。

1.1.2 化學(xué)試劑

蛋白胨、酵母浸粉（生化試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；牛凝血酶（1 000 U/支）、牛纖維蛋白原（純度＞85%）（沈陽拜英生物技術(shù)有限公司）；注射用尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品（100 000 IU/支，武漢人福藥業(yè)有限責(zé)任公司）；酪蛋白（生化試劑，Sigma公司）；蒽酮、三氯乙酸、氫氧化鈉（分析純，上海國藥）；鄰苯二甲酸氫鉀（基準(zhǔn)試劑，國家標(biāo)物中心）；甲醇、乙腈、乙酸（色譜級，美國默克公司）；大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC級，上海源葉生物科技有限公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

改良LB培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[7]。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平ME104/02、pH計FE28-Standard（瑞士Mettler Toledo公司）；紫外可見光分光光度計Cary300（美國Varian公司）；液相色譜儀WATRTS ACQUITY UPLC H-CLASS（美國沃特斯公司配紫外檢測器）；凱氏定氮儀2300 k（丹麥FOSS公司）；超凈工作臺SW-CJ-1G（蘇州凈化設(shè)備股份公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵液制備及培養(yǎng)

按照文獻(xiàn)[7]培養(yǎng)。10 000 r/min，4 ℃離心15 min，棄去上清液，用超純水復(fù)溶菌體，得到活菌數(shù)為3×107～5×107CFU/mL的發(fā)酵液。

1.3.2 納豆樣品制備

納豆加工按照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行，5%接菌量，37 ℃發(fā)酵18 h，4 ℃冰箱冷藏。

樣品分別在0，1，3，6和9 d取樣，活菌數(shù)、納豆激酶和氨基酸態(tài)氮立即測定，其余樣品冷凍干燥，粉碎后過孔徑0.180 mm篩，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 活菌數(shù)測定

采用稀釋平板法測定菌落總數(shù)。

1.3.4 理化指標(biāo)測定

粗蛋白，按照GB/T 5009.5—2016[8]方法測定；可溶性總糖，采用蒽酮-濃硫酸比色法[9]測定；脂肪含量，采用索氏提取法[10]測定。氨基酸態(tài)氮，參考GB 5009.235—2016[11]方法進(jìn)行測定。

1.3.5 納豆激酶活力測定

參考Astrup等[12]纖維蛋白平板法測定。用生理鹽水將注射用尿激酶逐級稀釋成濃度為2 000，1 000，500，250和100 IU/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。其余按照文獻(xiàn)[7]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取2.00 g研磨均勻的納豆，加入20 mL生理鹽水，按照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行測定，根據(jù)尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線計算。

1.3.6 樣品中大豆異黃酮含量測定

參照馬玉榮等[13]的方法，略作修改。HPLC色譜條件：色譜柱，C18柱2.1 mm×100 mm，1.7 μ m；波長260 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量35 μ L；流速0.5 mL/min。流動相：A乙腈（0.1%乙酸）；B水（0.1%乙酸）。梯度洗脫：0～0.5 min，10% A，90% B；0.5～2 min，10%～12% A，90%～88% B；2～7 min，12%～45% A，88%～55% B；7～7.1 min，45%～90% A，55%～10% B；7.1～9 min，90% A，10% B；9～9.01 min，90%～10%A，10%～90% B；9.01～12 min，10% A，90% B。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：將大豆苷（Daidzin）、大豆黃苷（Glycitin）、染料木苷（Genistin）、大豆素（Daidzein）、黃豆黃素（Glycitein）、染料木素（Genistein）標(biāo)準(zhǔn)品配制成不同濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液，以峰面積為縱坐標(biāo)（y），濃度為橫坐標(biāo)（x）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定：準(zhǔn)確稱取0.500 0 g樣品于25 mL具塞試管中，加10 mL 90%甲醇溶液，超聲提取30 min，渦旋振蕩30 s，繼續(xù)超聲處理30 min，上清液10 000 r/min離心5 min，過0.22 μ m針孔式濾膜測定。按保留時間定性，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中異黃酮含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗3次重復(fù)，用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯性分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用Origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種小粒豆原料主要成分分析

有研究表明以小粒豆為原料制作納豆最佳[14]。從表1中可以看出，不同品種大豆各成分含量存在一定的差異，103號和8號水分含量較高。3種小粒豆粗蛋白含量以2號和8號含量較高；脂肪含量差異顯著（p＜0.05），8號最高、103號脂肪含量最低。103號和8號可溶性總糖含量接近，顯著高于2號豆。3種小粒豆均滿足納豆原料高蛋白、低脂肪的要求。

表1 3種黃豆主要成分含量（干基） %

2.2 納豆活菌數(shù)在貨架期內(nèi)變化

從圖1可知，3種不同小粒豆制成的納豆在貨架期內(nèi)，隨著時間延長，活菌數(shù)均呈現(xiàn)下降趨勢。其中，2號和8號均在發(fā)酵完成時活菌數(shù)最高，分別為1.5×109CFU/g和7.2×109CFU/g，而103號在冷藏第1天時，活菌數(shù)最高，為1.3×109CFU/g。總的來看，3種納豆在冷藏0～1 d時活菌數(shù)最高，且活菌數(shù)與李宏梁等[15]研究的10種市售納豆活菌數(shù)差異不大。納豆菌芽孢結(jié)構(gòu)有耐受環(huán)境脅迫的能力[16]，可在人體腸道中定植生長促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收[2]，對人類健康起到重要作用，并且與NK含量具有密切聯(lián)系[17]。因此選擇合理時間食用，才能發(fā)揮納豆菌功效，同時考慮適當(dāng)后熟納豆風(fēng)味豐富，1 d左右食用較好。

圖1 3種納豆菌活菌數(shù)在貨架期的變化

2.3 納豆NK活性在貨架期內(nèi)變化

尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.209 8x+2.109 8（R2=0.995 4）。根據(jù)纖維蛋白平板法測定不同貨架期3種納豆粗酶液中的NK活性。圖2顯示，貨架期內(nèi)3種NK活性均呈現(xiàn)出先上升后下降趨勢。2號和8號在冷藏3 d時，NK活性最高，分別為（4 046±360）IU/g和（4 198±279）IU/g；而103號在冷藏第1天時，NK活性最高，為（2 834±486）IU/g。結(jié)合圖1，103號活菌數(shù)與NK活性在冷藏階段生長趨勢基本一致；2號和8號納豆的活菌數(shù)在整個貨架期內(nèi)均呈現(xiàn)下降趨勢，而NK活性表現(xiàn)出前3 d增加而后下降趨勢，說明NK在這2種大豆上的合成模式是延續(xù)合成型[18]。冷藏時間繼續(xù)延長，由于納豆菌菌體衰老和死亡，酶促反應(yīng)及代謝反應(yīng)速率降低或終止，酶活降低[4]，3種納豆NK活性持續(xù)緩慢下降。3種納豆NK活性高，均滿足已報道的商業(yè)化納豆要求[19]，在1～3 d之內(nèi)保健功效較好。

圖2 3種納豆NK活性在貨架期的變化

2.4 納豆理化指標(biāo)在貨架期內(nèi)的變化

根據(jù)圖3（A）和（B）可知，3種納豆在整個貨架期內(nèi)蛋白含量在45.21%～47.05%之間小幅度波動，脂肪含量在20.50%～22.24%之間，在9 d的貨架期內(nèi)變化不大。貨架期內(nèi)大分子蛋白一方面被水解成小分子多肽或者氨基酸，同時菌體蛋白大量積累[20]，這2個過程處于平衡狀態(tài)，蛋白含量變化不顯著；另一方面納豆菌生長過程中沒有消耗脂肪作為碳源，脂肪含量相對穩(wěn)定。從納豆蛋白含量和脂肪含量變化趨勢來看，貨架時間對其影響不大。

根據(jù)測定結(jié)果，見圖3（C），可溶性總糖作為優(yōu)質(zhì)碳源，在納豆發(fā)酵過程中被納豆菌利用，發(fā)酵后冷藏期間的可溶性總糖含量約為表1中原料的46.00%～66.39%。103號在冷藏1 d時，2號和8號納豆則在冷藏3 d時可溶性總糖含量最低。3種納豆可溶性總糖含量在整個貨架期內(nèi)變化不大，含量在4.29%～5.60%之間，因為在貨架期過程中，納豆菌菌體生長緩慢逐漸消亡，不需要可溶性總糖提供碳源，所以可溶性總糖含量處于相對穩(wěn)定狀態(tài)。

圖3 3種納豆理化指標(biāo)在貨架期的變化

食品發(fā)酵過程中氨基酸不僅能賦予發(fā)酵食品甜、苦、澀等多種味覺特征[21]，還可為微生物生長代謝提供氮源，促進(jìn)發(fā)酵作用[22]，是食品發(fā)酵工業(yè)的一個重要指標(biāo)，而氨基酸水平通常用氨基酸態(tài)氮表征，來衡量原料蛋白的水解程度、氮源水平及產(chǎn)品質(zhì)量等[23]。根據(jù)圖3（D）可知，3種納豆氨基酸態(tài)氮含量在貨架期內(nèi)，都表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，因為貨架前期，后熟時間較短，可能發(fā)酵不完全，產(chǎn)生的酶不足以分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生游離氨基酸；后熟發(fā)酵時間過長，游離氨基酸可作為氮源被微生物利用，所以貨架后期，氨基酸態(tài)氮含量下降。103號、2號和8號氨基酸態(tài)氮含量最高值分別出現(xiàn)在冷藏第1，第6和第3天，含量分別為0.58%±0.01%，0.61%±0.00%和0.52%±0.01%。從3種納豆氨基酸態(tài)氮含量在貨架期內(nèi)變化可知，比較理想的食用時間應(yīng)在1～6 d，此時氨基酸態(tài)氮含量較高，納豆風(fēng)味濃郁。

2.5 不同時期納豆中大豆異黃酮含量的變化

大豆異黃酮是一種非固醇類、多酚類混合物，具有緩解骨質(zhì)疏松和更年期癥狀、降低膽固醇和預(yù)防癌癥等生理功能。主要分為糖苷型異黃酮和苷元型異黃酮，其中苷元型異黃酮比糖苷型異黃酮更易被人體消化吸收，功能性更強，微生物發(fā)酵可使大豆異黃酮糖苷型向苷元型轉(zhuǎn)化，提高其生物活性[24]，對3種納豆原料和貨架期內(nèi)，異黃酮總量和構(gòu)成變化進(jìn)行研究總結(jié)，可為納豆產(chǎn)品開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

納豆原料和貨架期過程中異黃酮總量變化如表2所示。3種小粒豆異黃酮總量在2 370.2～3 530.4 mg/kg之間，其中糖苷型異黃酮含量是異黃酮總量的91.0%～92.9%。發(fā)酵完成0 d時，103號和8號兩種納豆異黃酮總量顯著高于原料豆（p＜0.5），而2號與原料豆差異不顯著（p＞0.5）。納豆發(fā)酵前經(jīng)過浸泡和蒸煮兩步加工程序后，小粒豆結(jié)構(gòu)被破壞、變得松散，釋放出大豆異黃酮數(shù)量較多，所以發(fā)酵后異黃酮提取率升高[25]。而隨著貨架期的延長，異黃酮總量均出現(xiàn)下降趨勢，索化夷等[26]在研究豆豉后酵過程中發(fā)現(xiàn)異黃酮總量的下降是納豆菌的生理活動引起的。3種納豆貨架期在3 d之內(nèi)異黃酮含量較高，保健效果較好。

納豆原料和貨架期過程中苷元型大豆異黃酮變化如表2所示。發(fā)酵后，納豆的苷元型異黃酮總量較原料豆有顯著提高；貨架期，3種納豆苷元型異黃酮總含量最高分別為（2 197.4±133.6）mg/kg，（1 551.5±15.7）mg/kg和（1 381.7±14.3）mg/kg，是原料豆的12，4.9和8.1倍。苷元型異黃酮含量占異黃酮總量的比例，則分別從原料的7.1%，9.0%和7.2%上升到貨架期最高值的36.1%，39.8%和25.1%。大豆素和染料木素是2種主要的苷元型異黃酮。貨架期內(nèi)，大豆素含量最高時較原料豆分別增加19.8%，5.6%和7.4%，染料木素則分別增加3.8%，8.1%和10.1%，說明大豆經(jīng)過納豆菌發(fā)酵及貨架期后酵，可有效提高異黃酮的生物活性。異黃酮發(fā)生轉(zhuǎn)化是因為納豆菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶的作用，該酶可作用于糖苷型異黃酮分子中的氧苷鍵，使其葡萄糖苷基團(tuán)脫掉，從而轉(zhuǎn)化成具有更高生物活性的苷元型異黃酮[24-25]。

3種納豆苷元型異黃酮含量最高點出現(xiàn)在貨架期0～1 d之內(nèi)，隨著貨架期延長其含量下降。有研究表明，苷元型異黃酮并不是異黃酮轉(zhuǎn)化的最終產(chǎn)物，如大豆素可在特定微生物作用下轉(zhuǎn)化為化學(xué)結(jié)構(gòu)更有穩(wěn)定、功能性更強的代謝終產(chǎn)物——雌馬酚[27]，由此推斷納豆中苷元型異黃酮有可能進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其他代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致貨架后期其含量降低，對于納豆中苷元型大豆異黃酮的轉(zhuǎn)化需要進(jìn)一步研究。3種不同納豆在整個貨架期異黃酮總量及糖苷型和苷元型含量變化規(guī)律顯示，貨架期不易過長，0～3 d是最佳食用時間。

表2 3種納豆不同時期大豆異黃酮各組分含量變化

3 結(jié)論

測定3種納豆中的活性成分含量在貨架期內(nèi)的變化趨勢，結(jié)果表明，3種納豆中的幾種營養(yǎng)活性物質(zhì)在貨架期期間有不同程度的變化。其中，蛋白質(zhì)、脂肪、可溶性總糖含量整體相對穩(wěn)定；活菌數(shù)在0～1 d時菌體數(shù)最高；NK呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，并且均在1～3 d時達(dá)到峰值；氨基酸態(tài)氮含量在貨架期間呈現(xiàn)出先升高后下降趨勢，103號、2號和8號豆分別在貨架期第0，第3和第6天時含量最高；異黃酮總量與苷元型異黃酮總量變化趨勢相同，表現(xiàn)為緩慢下降或者前期增加然后下降的趨勢，異黃酮總量最高點在0～3 d之內(nèi)，苷元型異黃酮總量峰值也分別出現(xiàn)在貨架期0～1 d之間。

大部分活性物質(zhì)含量在貨架期內(nèi)表現(xiàn)出先上升后下降趨勢。綜合3種納豆在貨架期營養(yǎng)指標(biāo)變化，認(rèn)為貨架期3 d之內(nèi)食用，納豆中活性成分如NK活力較高、苷元型異黃酮等物質(zhì)含量較高，能更好地發(fā)揮納豆的保健功效，并且3種納豆活菌數(shù)、NK活性等指標(biāo)均高于市售納豆。試驗結(jié)果可為納豆貨架期冷藏及合理食用提供參考。有關(guān)不同生產(chǎn)工藝、納豆中其它品質(zhì)在貨架期中的變化，以及大豆異黃酮含量變化及機制有待進(jìn)一步研究。