王奕芳，陳茂彬，張玉，李琴，方尚玲

1. 湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院（武漢 430068）；2. 湖北省釀造工藝與裝備工程技術(shù)中心（武漢 430068）

麻城釀造老米酒有千年的歷史，主要產(chǎn)于麻城市東部地區(qū)的木子店、東古城等地。由糯米和特殊的金銀花酒曲制成，色澤清亮，味道淳甜，含有豐富的營養(yǎng)成分和功能成分[1]，因而深受人民群眾歡迎。麻城老米酒屬于黃酒的一種，與黃酒相同的也含有有機(jī)酸和γ-氨基丁酸。

“無酸不成酒”，酸既能有效降低酒的甜度，又可以有效增加酒的濃厚感，并且酸還是酒產(chǎn)香味的前體物質(zhì)[2-4]。酒中含有多種有機(jī)酸，包括揮發(fā)性酸和非揮發(fā)性酸。乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等有機(jī)酸，屬于揮發(fā)性酸，它們的相對分子質(zhì)量越小，刺激性越強(qiáng)，適量的揮發(fā)性酸可以有效幫助酒的香氣形成，超過一定量則可能會導(dǎo)致酒的口感偏酸；乳酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸等屬于不揮發(fā)性酸，它們能增加酒的醇厚感[5-7]。適量的酸可以在酒中起到調(diào)節(jié)和緩沖諸味的作用，但是酸度過高或過低，將會導(dǎo)致酒的品質(zhì)下降[8]。由此可見，有機(jī)酸的含量作為酒中重要的呈味物質(zhì)，對酒的口感滋味和品質(zhì)也有著較大的影響，因而進(jìn)一步明確麻城老米酒中有機(jī)酸的種類及有機(jī)酸含量也是極為必要的[9-10]。此外，有機(jī)酸對于改善胃腸道的消化功能、抗疲勞等保健功能等方面也具有重要的意義。比如蘋果酸具有抗疲勞、保護(hù)肝臟和增強(qiáng)心臟功能的作用，而檸檬酸和乙酸則具有抗老化、抗疲勞和降低血壓等作用[11]。目前，用于測量有機(jī)酸的方法有紅外光譜法、酸堿滴定法、分光光度法、毛細(xì)管電泳法、反相高效液相色譜法、氣相色譜法和離子色譜法等。然而，這些方法前處理都很繁瑣，而且能達(dá)到同時分離的有機(jī)酸種類較少[12]，而高效液相色譜法（HPLC）具有靈敏度高、分辨率高、重現(xiàn)性好、測定準(zhǔn)確和快速等優(yōu)點[2,8]。

試驗以糯米為原料，經(jīng)半固態(tài)發(fā)酵釀造獲得富含多種活性成分的麻城老米酒，采用高效液相色譜法（HPLC）全面著重分析麻城老米酒中的有機(jī)酸含量，旨在了解麻城老米酒中主要成分的含量，為麻城老米酒工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麻城老米酒：麻城市某酒廠生產(chǎn)的3種不同類型的酒，分別為c1（在米曲中添加酵母K）、c2（在米曲中添加酵母cxds）、c3（在米曲中添加酵母S）。

草酸、酒石酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、磷酸二氫鉀（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丙酮酸：阿拉丁試劑公司；L-蘋果酸：上海麥克林生化科技有限公司；甲醇（均為色譜純）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate 3000高效液相色譜儀及檢測器：美國Thermo Scientific公司；Sino Chrom ODS-BP（250 mm×4.6 mm，5 μm）：大連依利特分析儀器有限公司；DTD-3R超聲波清洗儀：湖北鼎泰精銳儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 麻城老米酒釀造工藝

糯米→選料→浸泡→濾水→水洗→蒸飯→攤涼→拌曲、加水→裝缸→發(fā)酵→壓榨→澄清→滅菌→成品

1.3.2 操作要點

選料：選取顆粒飽滿、無雜質(zhì)、無霉變的糯米。

浸泡：秋季浸米的時長8～10 h，浸米水溫20～25℃，冬季浸米的時長12～15 h，浸米水溫10～15 ℃。

濾水、水洗：把浸米的水濾掉之后，再用清水清洗2～3遍即可。

蒸飯：蒸米以蒸汽冒出時開始計時，出蒸汽15～20 min，蒸出的米要求米粒松、軟、透、不粘連。

攤涼：是在潔凈衛(wèi)生竹制涼席上自然降溫，冷卻至20～30 ℃。

拌曲、加水、裝缸：先在缸內(nèi)撒一層曲，然后一層米一層曲，直到把原料放完（1缸是50 kg米），最后倒入水，再撒入剩余的曲，封缸發(fā)酵（發(fā)酵中途不能開缸）。

發(fā)酵：在20 ℃左右的情況下，發(fā)酵1個月。

壓榨、澄清：經(jīng)30 d發(fā)酵，酒液開始澄清，說明發(fā)酵基本結(jié)束，此時可以開壇取酒，把酒裝入壓榨機(jī)進(jìn)行壓榨，讓酒糟分離。壓榨出來的酒通過沉淀后，裝入酒瓶中。

滅菌：75 ℃滅菌15～20 min。

1.3.3 流動相的配制

稱取6.800 0 g KH2PO4，用超純水溶解KH2PO4定容至1 000 mL，得到濃度為0.05 mol/L的磷酸二氫鉀，用磷酸調(diào)pH至2.90。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取草酸、酒石酸、L-蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酮酸各0.03，0.30，0.12，0.40，0.55，0.45，0.50和1.00 g，用濃度為0.05 mol/L的磷酸二氫鉀溶解于25 mL的容量瓶中定容，制成混合酸標(biāo)準(zhǔn)樣品液。將上述標(biāo)準(zhǔn)樣品液用磷酸二氫鉀稀釋5，10，25，50和100倍，并分別進(jìn)樣分析作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 樣品前處理方法

取少量酒樣分裝在離心管中，在10 000 r/min條件下離心20 min，再通過0.22 μm過濾膜過濾后，直接進(jìn)樣。

1.3.6 色譜條件

色譜柱為Sino Chrom ODS-BP（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A為甲醇，流動相B為0.05 mol/L的磷酸二氫鉀，并使用梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1。流速0.8 mL/min，紫外檢測波長210 nm，進(jìn)樣量20 μL。

表1 梯度洗脫程序

1.3.7 定性定量方法

定性：在選定的色譜條件下，確定每種物質(zhì)的保留時間。

定量：將標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度稀釋成一系列濃度后，在選定的色譜條件下，以對照的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的選擇

在波長210 nm附近許多緩沖溶液具有強(qiáng)吸收，因此增加了本底值，靈敏度下降，有時根本不能進(jìn)行測定。磷酸鹽緩沖溶液是最典型、適用的洗脫液，在紫外區(qū)域幾乎沒有明顯的吸收，可以利用它作為流動相來測定有機(jī)酸[13-15]。磷酸鹽緩沖溶液濃度的高低直接影響其緩沖容量的大小及緩沖溶液的離子強(qiáng)度，從而直接影響色譜柱的分離效果。磷酸鹽緩沖溶液的濃度越高，酸的存在形式越穩(wěn)定，但緩沖溶液的濃度不能太高，因為其溶液濃度增高時，離子強(qiáng)度也會增大，這樣不利于組分的分離，同時也影響柱子的使用壽命，增加了流動相的本底吸收，降低了測定的靈敏度。參考文獻(xiàn)[10]，選擇濃度為0.05 mol/L的磷酸二氫鉀為流動相水相。

當(dāng)不加有機(jī)相時，草酸、酒石酸和檸檬酸不能很好分離；當(dāng)加入甲醇后，8種有機(jī)酸能很好地分離，所以選擇加有機(jī)相。

2.2 流動相流速確定

分別選擇流動相流速0.50，0.70，0.80和1.0 mL/min作試驗，發(fā)現(xiàn)0.5～0.8 mL/min范圍內(nèi)分離效果相差不大。流速越低，分析時間就越長，柱效也會變得越差，因此，確定流速為0.8 mL/min。

2.3 色譜條件的確定

從上述試驗中，最終確定分離有機(jī)酸的色譜條件是檢測波長210 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，甲醇與0.05 mol/L的磷酸二氫鉀梯度洗脫（表1）。在該色譜條件下進(jìn)樣，得到標(biāo)準(zhǔn)樣品中8種有機(jī)酸的分離色圖譜和保留時間。

由圖1可見，8種有機(jī)酸得到了很好分離。在13 min之內(nèi)，8種物質(zhì)就能得到分離，且洗脫程序不復(fù)雜，分離效果良好。

由圖1和圖2可以看出，圖1各標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰型沒有圖2的峰型好看，且圖1的分離效果也沒有圖2的好，說明用流動相1∶1稀釋樣品得出的峰分離效果更佳。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限

采用以上確定的色譜條件，得到以下8種有機(jī)酸的回歸方程，由表2可知，相關(guān)系數(shù)R均大于0.999 0，說明線性關(guān)系良好。各組分目標(biāo)物的檢出限為0.072～0.104 mg/L，滿足不同種類物質(zhì)的檢測要求。

圖1 有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖（不加甲醇）

圖2 有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖

表2 8種有機(jī)酸回歸方程及檢出限

2.5 老米酒中有機(jī)酸物質(zhì)分析

按照1.3.5方法對老米酒樣品c1、c2、c3處理，對處理過的樣品進(jìn)行高效液相色譜分析，樣品中有機(jī)酸含量見表3。

由表3可知，3種不同類型的老米酒中含有豐富的有機(jī)酸，其中c1老米酒中含量最高的是乙酸，其次是乳酸、琥珀酸以及丙酮酸；c2老米酒中含量最高的是乳酸，其次是琥珀酸、乙酸以及檸檬酸；c3老米酒中含量最高的是乳酸，其次是琥珀酸、乙酸以及檸檬酸。從測定的這8種有機(jī)酸來看，乳酸、乙酸、琥珀酸是這3種老米酒中主要有機(jī)酸組成成分，占總含量的比例較大。而這3種酸在麻城老米酒發(fā)酵過程中扮演重要的角色，乙酸屬于揮發(fā)性酸，是導(dǎo)致酒有醇厚感的主要物質(zhì)；乳酸、琥珀酸屬于非揮發(fā)性酸，是使酒具有回味感的主要物質(zhì)[16-17]。同時，它們還賦予酒獨特的風(fēng)味。乳酸賦予酒的風(fēng)味是稍有澀感、尖利酸味；乙酸賦予酒的風(fēng)味是溫和、爽快酸味、有新鮮感，后苦短；琥珀酸賦予酒的風(fēng)味是酸、咸、苦復(fù)合味[18-19]。由此可見，這3種有機(jī)酸作為麻城老米酒有機(jī)酸重要組成部分，增添了麻城老米酒風(fēng)味的獨特性。而3種不同類型老米酒8種有機(jī)酸總量與紹興黃酒相比，含量相對較低，與米酒相比，含量稍高。這可能是由于紹興黃酒中的有機(jī)酸物質(zhì)主要來源于原料（大米、小麥）的轉(zhuǎn)化，特別是由于發(fā)酵周期長（傳統(tǒng)工藝酒達(dá)100 d左右），小麥帶皮發(fā)酵，麥皮中的大量物質(zhì)可以直接融入到酒中。老米酒發(fā)酵時長比紹興黃酒短，而比米酒長，另外，紹興黃酒一般用的酒曲是麥曲，而老米酒用的甜酒曲，這些原因都會導(dǎo)致有機(jī)酸物質(zhì)含量的不同。

表3 樣品有機(jī)酸含量的測定

3 結(jié)論

在選定的色譜條件下，首次采用高效液相測定麻城老米酒中的8種有機(jī)酸物質(zhì)，并且在13 min之內(nèi)使這8種物質(zhì)得到了較好的分離，8種有機(jī)酸物質(zhì)的回收率在95.6%～101.5%之間，其相對偏差在0.08%～0.25%之間，說明此測定方法準(zhǔn)確可靠。

由以上試驗可知，麻城老米酒中含有一定量的有機(jī)酸物質(zhì)。3種不同類型的老米酒中含有豐富的有機(jī)酸，其中c1老米酒中含量最高的是乙酸，其次是乳酸、琥珀酸以及丙酮酸，c2老米酒中含量最高的是乳酸，其次是琥珀酸、乙酸以及檸檬酸，c3老米酒中含量最高的是乳酸，其次是琥珀酸、乙酸以及檸檬酸。從測定的這8種有機(jī)酸來看，乳酸、乙酸、琥珀酸是這3種老米酒中主要的有機(jī)酸物質(zhì)，占總含量的比例較大。通過其測定結(jié)果與紹興黃酒、米酒中有機(jī)酸物質(zhì)含量的對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)麻城老米酒中有機(jī)酸物質(zhì)的含量與其工藝密切相關(guān)，為老米酒類產(chǎn)品的開發(fā)和保健功能的研究提供依據(jù)。

此次試驗只對麻城老米酒中的有機(jī)酸進(jìn)行了檢測，而麻城老米酒中不僅僅只含有了有機(jī)酸，還含有其他的功能成分，比如氨基酸、維生素等，有待進(jìn)一步的研究。