陳銘中，吳海珍，劉志芳，陳勇，鐘旭美

陽江職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與環(huán)境工程系（陽江 529566）

青梅又稱果梅、酸梅，屬于薔薇科，是一種營養(yǎng)豐富，具有多重保健功能的水果，是一種釀造果酒的優(yōu)質(zhì)原料[1]。青梅果肉富含多種維生素、17種氨基酸、檸檬酸、酒石酸以及谷甾醇、黃酮類多種保健營養(yǎng)成分[2]。青梅是典型的強(qiáng)生理堿性食品，能中和酸性食物，具有生津止渴、增進(jìn)食欲、殺菌解毒、凈化血液、預(yù)防高血壓、腦溢血及抑制多種腫瘤等功效[3]，還有研究發(fā)現(xiàn)青梅及其制品有具有緩解、消除疲勞、防老抗衰、美容養(yǎng)顏的功效[4]。青梅中含有豐富有機(jī)酸，其中檸檬酸是促進(jìn)人體細(xì)胞代謝必不可少的酸，它能促進(jìn)乳酸分解為二氧化碳和水排出體外[5]，對人體保持體力具有重大意義。青梅保健功能強(qiáng)以及營養(yǎng)豐富，其果酒制品一直深受人們青睞，以青梅汁為原料，經(jīng)酵母發(fā)酵得到一種低酒精度的果酒，是適合于廣大人群飲用的飲品。藍(lán)莓果酒、山楂果酒等果酒的活性成分多數(shù)以有機(jī)酸、黃酮類化合物以及清除自由基作為果酒主要功效成分考察指標(biāo)[6]。饒炎炎等[7]通過研究紅樹莓發(fā)酵階段有機(jī)酸、活性成分和香氣的動態(tài)變化作為紅樹莓的功效評價指標(biāo)，而青梅酒的功效成分以有機(jī)酸、黃酮類化合物及清除自由基報(bào)道甚少。此次試驗(yàn)充分利用陽江市陽春地區(qū)的特色農(nóng)產(chǎn)品青梅釀造出的青梅酒，對不同酵母發(fā)酵的青梅酒進(jìn)行成分和抗氧性評價，得出合適于青梅發(fā)酵的酵母，為青梅的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青梅，陽江市陽春地區(qū)果園；青梅酒，食品加工實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵的青梅酒。

1, 1-二苯基-2-3硝基苯肼（DPPH），福州飛凈生物科技有限公司；蘆丁、2, 2-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（ABTS）、2, 4, 6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、硫酸亞鐵、三氯化鐵，上海源葉生物科技有限公司；氫氧化鈉、亞硝酸鈉、氯化氫、硝酸鋁、無水乙醇、乙酸鈉、過硫酸鉀、磷酸二氫鉀、磷酸，廣州化學(xué)試劑廠；草酸、酒石酸、莽草酸、蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸，均為AR級，上海麥克林生化科技有限公司；甲醇，色譜純，星馬克科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

I3紫外可見分光光度計(jì)，濟(jì)南海能儀器有限公司；FA224電子天平，上海舜宇恒平科技儀器有限公司；恒溫水溶鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TGL-18臺式高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；KQ-250E超聲清洗器，昆明市超聲儀器有限公司；1200高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；PHS-3F型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；FBZ1002-UP-P超純水機(jī)，青島富勒姆科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 青梅酒樣品

青梅酒樣品是根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究優(yōu)化的發(fā)酵條件和選擇的酵母而發(fā)酵得到4種不同的青梅果酒A、B、C、D[8]，其中果酒A為安琪RW酵母發(fā)酵的青梅果酒，果酒B為帝伯仕RC212酵母發(fā)酵的青梅果酒，果酒C為安琪RW酵母和EC118酵母混合發(fā)酵（比例是1∶1）的青梅果酒，果酒D為帝伯仕RC212酵母和D254酵母混合發(fā)酵（比例是1∶1）的青梅果酒。

1.3.2 4種青梅酒總黃酮含量的測定

1) 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[9-11]

稱取29.8 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用適量的60%乙醇溶液將其溶解，定容至100 mL容量瓶。取0，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00和6.00 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于25 mL比色管中，加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置；加入1 mL 10%的硝酸鋁溶液，搖勻，靜置；先加入10 mL 4%的氫氧化鈉溶液，再加入60%的乙醇溶液定容至刻度，靜置顯色10 min。用分光光度計(jì)在510 nm處分別測定其吸光度，空白試劑作參比，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。

2) 總黃酮含量的計(jì)算

各取2 mL 4種不同酵母發(fā)酵的青梅酒于25 mL比色管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線相同操作，得出不同酵母發(fā)酵的青梅酒的吸光度，利用回歸方程和吸光度計(jì)算青梅酒中總黃酮的含量（以蘆丁計(jì)）。

1.3.3 4種青梅酒抗氧化活性的測定

1) DPPH自由基清除能力的測定[12-13]

各取0.1 mL 4種不同酵母發(fā)酵的青梅酒加入到25 mL比色管中，然后向每管中加入3.9 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液，混勻避光37 ℃，水浴1 h后在517 nm下測定吸光度，以無水乙醇做空白對照。

式中：Ab為空白對照管的吸光度；As為樣品測定管的吸光度。

2) ABTS+自由基清除能力的測定[14-15]

配制ABTS+儲備液：配制2.45 mmol/L過硫酸鉀，用過硫酸鉀溶解ABTS+，配成7 mmol/L ABTS+儲備液，在室溫、避光條件下靜置12～16 h，儲備液可穩(wěn)定3～4 d。配制ABTS+測定液：以磷酸緩沖液（10 mmol/L，pH 7.4）稀釋，使其吸光度在734 nm波長達(dá)到0.700±0.020。測定：取4 mL ABTS+測定液，加入60 μL樣品待測液，振蕩30 s，反應(yīng)一定時間后測定在734 nm波長處的吸光度，根據(jù)式（2）計(jì)算ABTS+自由基清除率。

式中：A樣品為樣品在734 nm波長處的吸光度。

3) FRAP自由基清除能力測定[15]

取30 μL樣品溶液加入900 μL FRAP工作液，定容至10 mL，混勻，在37 ℃的水溶10 min，于593 nm波長出測其吸光度。其中FRAP工作液由20 mmol/L TPTZ溶液（用40 mmol/L的HCl溶液配制）、20 mmol/L的FeCl3·6H2O溶液、0.3 mol/L pH 3.6乙酸鈉緩沖液，按10∶1∶1的體積比混合組成（現(xiàn)配現(xiàn)用）。同樣，按照上述方法，以0.1～2.0 mmol/L的FeSO4的標(biāo)準(zhǔn)溶液代替樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 4種青梅酒有機(jī)酸測定[16-17]

測定條件：色譜柱Agilent SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相0.5% KH2PO4水溶液，用H3PO4調(diào)節(jié)pH 2.6，使用前經(jīng)0.22 μm微孔濾膜減壓過濾；流速0.4 mL/min；柱溫20 ℃；UVD檢測器；檢測波長214 nm，進(jìn)樣量20 μL；標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液用前均經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜過濾。

1) 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)液的測定[18]

分別準(zhǔn)確稱取50.0 mg草酸、酒石酸、莽草酸、蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸，用去離子水定容至10 mL，配成5 g/L標(biāo)準(zhǔn)液，為有機(jī)酸的混合標(biāo)準(zhǔn)液。經(jīng)0.22 μL微孔濾膜過濾后進(jìn)行HPLC測定。

2) 樣液的測定

分別吸取5.0 mL 4種不酵母發(fā)酵的青梅酒，以11 000 r/min離心15 min，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行HPLC測定[19]。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算青梅酒有機(jī)酸的含量。

式中：Cx為青梅酒有機(jī)酸的質(zhì)量濃度，g/L；Ax為青梅酒有機(jī)酸的峰面積；CS為有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度，g/L；AS為有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)液的峰面積。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)做3次平行測定，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差的形式表示，數(shù)據(jù)采用Origin Pro 2019b繪圖，SPSS 21統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)（Duncan，p＜0.05）[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種青梅酒總黃酮含量的測定

2.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)方差為y=0.373 2x-0.002 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，結(jié)果表明在一定質(zhì)量范圍內(nèi)，蘆丁質(zhì)量濃度與吸光度間有很好的相關(guān)性。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 不同酵母發(fā)酵的青梅酒總黃酮含量比較

由圖2可知，不同酵母發(fā)酵的青梅酒總黃酮含量不一樣，果酒A（安琪RW酵母）與果酒D（帝伯仕RC212、D254酵母）的總黃酮含量較高，抗氧化能力較強(qiáng)[21]。不同酵母發(fā)酵的青梅酒總黃酮含量從高到低順序?yàn)楣艱＞果酒A＞果酒C＞果酒B。通過顯著性差異分析，果酒A與果酒D總黃酮含量差異不顯著，果酒B與果酒C總黃酮含量差異不顯著，果酒A與果酒B、C總黃酮含量顯著差異，果酒D與果酒B、C總黃酮含量差異顯著，這表明酵母類型對青梅酒的總黃酮含量有一定的影響，其中使用安琪RW酵母發(fā)酵或帝伯仕RC212、D254酵母混合發(fā)酵能使青梅酒具有較高的總黃酮含量。

圖2 不同酵母發(fā)酵的青梅酒總黃酮含量比較

2.2 4種青梅酒抗氧化活性分析

2.2.1 DPPH自由基清除能力

由圖3可知，不同酵母發(fā)酵的青梅酒的DPPH自由基清除率均較高，其強(qiáng)弱順序?yàn)楣艫（87.1%）＞果酒B（85.2%）＞果酒D（84.3%）＞果酒C（73.8%），并且果酒A、B、D的DPPH自由基清除率均高于80%，而果酒C的DPPH自由基清除率低于75%，果酒A與果酒B、C、D的DPPH清除能力差異顯著，果酒B與果酒C的DPPH清除能力差異顯著，果酒B與果酒D的DPPH清除能力差異不顯著，表明不同酵母對青梅酒的DPPH清除能力有很大的影響，而DPPH被廣泛應(yīng)用于測定自由基的清除能力[22]，使用安琪RW酵母、帝伯仕RC212酵母和混合酵母（帝伯仕RC212+D254酵母）發(fā)酵得到的青梅酒均具有較高DPPH清除能力，而安琪RW、EC118酵母混合發(fā)酵得到的青梅酒的DPPH清除能力相對低。

圖3 不同酵母對青梅酒DPPH清除率的影響

2.2.2 ABTS自由基能力

由圖4可知，4種青梅酒均具有一定的ABTS+自由基清除率能力，它們的清除率大小依次為果酒D（71.74%）＞果酒C（70.11%）＞果酒A（69.33%）＞ 帝伯仕（66.86%），但它們的清除率沒有顯著差異，表明4種果酒ABTS+清除率相當(dāng)，而果酒D的清除率最大。

圖4 不同酵母對青梅酒ABTS自由基清除率的影響

2.2.3 FRAP自由基清除能力

由圖5可知，F(xiàn)eSO4在濃度0～2.0 mmol/L范圍內(nèi)與其在593 nm處的吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.079 7x-0.001 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 0。

由圖6可知，4種酵母發(fā)酵的青梅酒FRAP值均大于0.085 mmol/L，同時有較大差異，F(xiàn)RAP值依次為果酒D＞果酒A＞果酒C＞果酒B，果酒D的FRAP值最高，達(dá)到0.094 mmol/L，果酒D與果酒A無顯著性差異，但與果酒B、C差異顯著；有研究表明抗氧化活性與樣品濃度呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)[23]，不同酵母發(fā)酵的青梅酒FRAP自由基清除能力會有差異，圖6表明果酒D（帝伯仕RC212、D254酵母）混合發(fā)酵的FRAP自由基清除能力最強(qiáng)。

圖5 FeSO4的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 不同酵母對青梅酒FRAP值的影響

2.3 4種青梅酒有機(jī)酸分析

由圖7可知，在參照文獻(xiàn)[9-10]的色譜條件略作修改后，青梅酒的有機(jī)酸能實(shí)現(xiàn)較好分離，表明確定的色譜條件適合4種青梅酒有機(jī)酸的分析。不同酵母青梅酒有機(jī)酸的含量見表1。4種青梅酒有機(jī)酸的含量除了果酒A存在蘋果酸含量最高外，從高到低順序趨勢大致為檸檬酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、乙酸、草酸、酒石酸、抗壞血酸，4種不同酵母發(fā)酵的青梅果酒檸檬酸含量均在7 g/L以上，其中果酒A的蘋果酸含量為11.813 g/L、果酒D的蘋果酸含量為7.104 g/L，不同果酒相同的有機(jī)酸基本存在顯著差異，可知4種果酒有機(jī)酸在不同酵母發(fā)酵條件下，4種青梅酒有機(jī)酸酸的含量有很大區(qū)別。果酒A中的乙酸、酒石酸沒有檢測到，果酒C中的乙酸、抗壞血酸也沒有檢測到，果酒A跟果酒D蘋果酸含量比較多，說明在不同的酵母發(fā)酵條件下，有一些有機(jī)酸可能由于發(fā)酵過程中酵母菌的代謝能力產(chǎn)生蘋果酸、乳酸、乙酸的功能以及發(fā)酵過程中部分乙酸、莽草酸、酒石酸可能發(fā)生了降解[12]，驗(yàn)證了果酒中的有機(jī)酸除來源于果酒釀造原料外，還會在果酒釀造過程中由微生物代謝產(chǎn)生[24]。果酒B與果酒D有機(jī)酸種類含量較多，全部有機(jī)酸都可檢測到，而果酒B跟果酒D都有帝伯仕RC212酵母參與發(fā)酵，總體說明不同酵母對青梅酒有機(jī)酸含量的影響很大。果酒D中的8種有機(jī)酸均有檢出，與其他3種果酒有機(jī)酸大致差異均顯著，各類有機(jī)酸含量均偏高，其中檸檬酸、草酸、莽草酸含量是4種不同酵母青梅酒中最高的，因此可知帝伯仕RC212、D254酵母混合發(fā)酵的青梅酒有機(jī)酸含量最豐富。從保健的角度看，應(yīng)選擇帝伯仕RC212、D254酵母混合發(fā)酵果酒更好，而且4種果酒中檸檬酸的含量均非常豐富，檸檬酸具有較強(qiáng)的保健作用，能促進(jìn)人體內(nèi)的乳酸分解、解除疲勞、抗衰老，并且能提高食欲、預(yù)防疾病等[11]，因此青梅酒的保健功效強(qiáng)。

圖7 有機(jī)酸混合標(biāo)液的液相色譜圖

表1 不同酵母發(fā)酵的青梅酒有機(jī)酸含量 g/L

3 結(jié)論

此次試驗(yàn)研究了青梅酒的抗氧化能力和有機(jī)酸兩方面。對4種不同酵母發(fā)酵的青梅酒進(jìn)行總黃酮含量、抗氧化能力和有機(jī)酸分析，結(jié)果顯示，不同酵母發(fā)酵的青梅抗氧化活性成分不同，有機(jī)酸的種類和含量均有區(qū)別，果酒中的有機(jī)酸的含量除了受原料、發(fā)酵條件的影響，同時還受不同酵母的影響。綜合幾個指標(biāo)分析，帝伯仕RC212、D254酵母混合發(fā)酵得到的果酒D的總黃酮含量、ABTS+清除率、FRAP值均是4種果酒中最高的，同時該酒中有機(jī)酸種類和含量均相對均衡，對降低血脂、補(bǔ)充能量、緩解疲勞有一定的促進(jìn)作用。因此，帝伯仕RC212、D254酵母混合發(fā)酵菌種可作為青梅酒開發(fā)的一種參考菌種。