佟抒洋，張書(shū)琪，郭雨晴，張俊健，張弛，呂艷芳

渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（錦州 121013）

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）廣泛存在于生物界，節(jié)肢動(dòng)物體中一般稱為酚氧化酶，植物中一般稱為多酚氧化酶，脊椎動(dòng)物、微生物和軟體動(dòng)物中一般稱為酪氨酸酶。在生物體內(nèi)，多酚氧化酶是黑色素合成的關(guān)鍵酶[1]，水果、蔬菜、對(duì)蝦等食品的褐變均與其活性有關(guān)，它是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的含銅金屬氧化酶。那么，金屬離子對(duì)其活性和結(jié)構(gòu)有怎樣的影響呢？蔣經(jīng)偉等[2]在研究菲律賓哈仔漆酶型酚氧化酶生化特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，Cu2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+能明顯抑制該酶的活性；周燕燕[3]研究金銀花中的多酚氧化酶時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同濃度Fe2+、K+、Mg2+、Cu2+、Ba2+、Ca2+等金屬離子對(duì)酚氧化酶的作用效果不同；Zheng等[4]研究湯普森無(wú)籽葡萄多酚氧化酶時(shí)發(fā)現(xiàn)，Zn2+和K+能夠抑制酶的活性，而Mg2+和Cu2+可以激活酶的活性；彭維等[5]研究發(fā)現(xiàn)不同的金屬離子對(duì)木聚糖酶和葡聚糖酶活力具有不同的影響，Na+、K+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Ca2+能激活葡聚糖酶活性，但Cu2+會(huì)抑制葡聚糖酶的活性，Na+、K+、Ca2+能激活木聚糖酶的活力。

近幾年隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的更新，通過(guò)紅外光譜、紫外光譜、熒光光譜等研究酶的結(jié)構(gòu)變化，可以了解酶結(jié)構(gòu)變化與其活性的關(guān)系。此次試驗(yàn)用不同濃度的Ba2+對(duì)南美白對(duì)蝦酚氧化酶進(jìn)行作用，然后研究處理后的南美白對(duì)蝦酚氧化酶活性和結(jié)構(gòu)的變化，從而為金屬離子對(duì)南美白對(duì)蝦PO酶活性與結(jié)構(gòu)的影響研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）養(yǎng)殖于遼寧錦州渤海灣，購(gòu)買時(shí)為活蝦，將蝦保持鮮活狀態(tài)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室，用冰猝死，將其頭胸部剪下，貯藏于-80 ℃超低溫冰箱備用。

L-多巴（L-β-（3, 4-二羥基苯）-丙氨酸，L-DOPA）（BR級(jí)）、十二烷基聚乙二醇醚（Brij-35，Sigma-Aldrich），北京中生瑞泰科技有限公司；曲酸（純度99%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DEAE-瓊脂糖凝膠FF（DEAE Sepharose Fast Flow）、葡聚糖凝膠G-100（Sephadex G-100），GE-Healthcare Amersham公司；其他試劑均為分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；蛋白電泳儀、GS-800圖像掃描儀，美國(guó)Bio-Rad公司；Milli-Q超純水裝置，美國(guó)Millipore公司；DK8D型電熱恒溫水槽，上海一恒科技有限公司；Biofuge stratos臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo Scientific公司；Scimitar2000 Near傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)安捷倫公司；970CRT型熒光分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)，上海青浦滬西儀器廠；原子力顯微鏡XE-70，Park Systems（韓國(guó)）公司。

1.3 方法

1.3.1 PO酶的制備

按照試驗(yàn)組前期已取得的成果[6]，將經(jīng)過(guò)分離純化、濃縮，酶活約為731 U/mL、蛋白含量約為1.2 mg/mL的PO酶，作為此次試驗(yàn)用酶。

1.3.2 不同濃度的Ba2+處理PO酶

在試驗(yàn)中首先測(cè)定了Cl-對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，試驗(yàn)中用NaCl為陰性對(duì)照進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明Cl-濃度在1×10-7～1 mol/L范圍內(nèi)，Cl-對(duì)PO酶活性的影響在誤差范圍內(nèi)，可以忽略，因此，可以忽略Cl-的干擾。

研究不同濃度的Ba2+對(duì)PO酶活性的影響。分別配制濃度為2，1，0.001和0.000 1 mol/L的氯化鋇溶液，在室溫下，分別與8 mL的PO酶混勻，作用30 min，使Ba2+（Ba2+）終濃度為0，100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6和10-7mol/L，經(jīng)過(guò)上述處理的酶，為此次試驗(yàn)用酶。

1.3.3 PO酶活性的測(cè)定

將2.2 mL pH 6.8、0.067 mol/L的磷酸緩沖液和2.2 mL L-DOPA混勻，置于45 ℃的恒溫水浴鍋中，水浴2 min后，加入0.6 mL已經(jīng)在45 ℃下預(yù)熱2 min的1.3.2處理后的PO酶，將反應(yīng)液立即倒入比色皿，選擇紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)動(dòng)力學(xué)模塊，在產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)475 nm下測(cè)定反應(yīng)液的吸光度變化，每隔5 s記錄1次吸光度，測(cè)定8 min，選取反應(yīng)體系吸光度為初速度區(qū)間數(shù)據(jù)計(jì)算酶活。一個(gè)酶活力單位（U）定義：?jiǎn)挝惑w積酶液（mL）在單位時(shí)間（min）內(nèi)使酶促反應(yīng)體系吸光度增加0.001[7-8]，用U（或U/mL）表示，見(jiàn)公式（1）。

式中：ΔA為吸光度變化量；t為反應(yīng)時(shí)間（min）；D為反應(yīng)體系總體積（mL）/參加反應(yīng)的酶液（mL）。

酶被Ba2+處理前后活性變化以相對(duì)酶活性表示，見(jiàn)公式（2）。

1.3.4 經(jīng)不同濃度Ba2+處理的PO酶紫外光譜掃描

將濃度為10-5，10-4，10-2，10-1和0 mol/L的經(jīng)Ba2+處理的PO酶進(jìn)行紫外光譜測(cè)定，酶濃度進(jìn)行適當(dāng)稀釋，符合紫外測(cè)定要求。使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定Ba2+處理的PO酶的紫外圖譜，掃描范圍為200～400 nm，狹縫寬度為1.0 nm，以未處理的PO酶為對(duì)照。

1.3.5 經(jīng)不同濃度Ba2+處理的PO酶內(nèi)源熒光強(qiáng)度測(cè)定

利用熒光光度計(jì)測(cè)定經(jīng)濃度為10-5，10-4，10-2，10-1和0 mol/L的Ba2+處理的PO酶的內(nèi)源熒光。試驗(yàn)方法參照Liu等[9]方法加以修改。將經(jīng)不同濃度Ba2+處理的PO酶液用磷酸緩沖液（0.067 mol/L，pH 7.2）進(jìn)行稀釋，使終濃度為0.08 mg/mL，選擇發(fā)射波長(zhǎng)λem=350 nm，檢測(cè)PO酶的最大激發(fā)波長(zhǎng)λex，然后在最大激發(fā)波長(zhǎng)下選擇發(fā)射波長(zhǎng)范圍。確定出的激發(fā)波長(zhǎng)λex=288 nm，發(fā)射波長(zhǎng)λem范圍確定為200～600 nm，狹縫矯正均為5 nm。

1.3.6 經(jīng)不同濃度Ba2+處理的PO酶紅外光譜的測(cè)定

將經(jīng)不同濃度Ba2+處理的PO酶冷凍干燥，取適量干燥的酶與適量KBr混合壓片，使用FTIR光譜儀測(cè)定PO酶的紅外光譜。在16 cm-1分辨率下，進(jìn)行400～4 000 cm-1全波段掃描，掃描200次，每個(gè)樣品檢測(cè)3次，收集樣品光譜。

參考前期相關(guān)研究[6]，采用Peak Fitv 4.12軟件，選取酰胺Ⅲ帶波段圖譜進(jìn)行基線調(diào)整、去卷曲、二階求導(dǎo)和曲線擬合，多次擬合使殘差（r2）大于0.99，根據(jù)各子峰的峰面積計(jì)算PO酶蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量[10-11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度Ba2+對(duì)PO酶活性的影響

不同濃度的Ba2+對(duì)酚氧化酶進(jìn)行處理，待反應(yīng)結(jié)束，對(duì)其酶活進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)酚氧化酶相對(duì)活性等于100%時(shí)，說(shuō)明Ba2+對(duì)酚氧化酶無(wú)作用；當(dāng)酚氧化酶相對(duì)活性低于100%時(shí)，說(shuō)明Ba2+對(duì)酚氧化酶活性具有抑制作用；當(dāng)相對(duì)活性高于100%時(shí)，說(shuō)明Ba2+對(duì)酚氧化酶具有激活作用。

如圖1所示，隨著B(niǎo)a2+濃度的增加，PO酶的活性變化趨勢(shì)為先上升后下降，當(dāng)Ba2+濃度為10-7～10-5mol/L時(shí)，酚氧化酶活性上升較快；當(dāng)Ba2+濃度為10-5mol/L時(shí)，相對(duì)酶活達(dá)到最大，即120.29%；當(dāng)Ba2+濃度為10-4～10-3mol/L時(shí)，相對(duì)酶活開(kāi)始下降，但酚氧化酶仍處于被激活狀態(tài)；當(dāng)Ba2+濃度為10-2～100mol/L時(shí)，酶活下降較快，Ba2+對(duì)酚氧化酶活性有抑制作用。因此，當(dāng)Ba2+濃度較小時(shí)，其對(duì)酚氧化酶具有激活作用，這可能是因?yàn)锽a2+的電子云排布中具有空軌道，能與酶蛋白分子中的—NH3、—COOH、—OH和CO—NH—等形成配位鍵，能夠?qū)γ傅幕钚灾行慕Y(jié)構(gòu)有一定的維持作用；但當(dāng)Ba2+濃度達(dá)到一定量后，其對(duì)酚氧化酶活性具有抑制作用，可能是過(guò)量的金屬離子促進(jìn)了酶蛋白的聚集作用，減少了底物與酶的結(jié)合，降低了酶促反應(yīng)速率，從而降低了酶的活性。根據(jù)Ba2+處理后的酚氧化酶活性的測(cè)定，選取經(jīng)Ba2+濃度0，1×10-5，1×10-4，1×10-2和1×10-1mol/L處理后的酶進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖1 不同濃度Ba2+對(duì)PO酶活性的影響

2.2 Ba2+對(duì)PO酶結(jié)構(gòu)的影響紫外光譜分析

如圖2所示，PO酶在274±1 nm附近有特征性吸收峰，其原因主要是蛋白質(zhì)肽鏈上的色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）殘基的芳香雜環(huán)π→π*躍遷引起的[12]。經(jīng)0 mol/L Ba2+作用的PO酶，其最大吸光度為0.26；經(jīng)1×10-5mol/L Ba2+作用的PO酶，其最大吸光度為0.322；經(jīng)1×10-4mol/L Ba2+作用的PO酶，其最大吸光度為0.362；經(jīng)1×10-2mol/L Ba2+作用的PO酶，其最大吸光度為0.326；經(jīng)1×10-1mol/L Ba2+作用的PO酶，其最大吸光度為0.302。隨著B(niǎo)a2+濃度的逐漸增大，吸光度呈先增大后減小的趨勢(shì)，并未發(fā)生紅移或藍(lán)移現(xiàn)象。結(jié)合圖1結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)處理PO酶的Ba2+濃度為1×10-5和1×10-4mol/L時(shí)，PO酶處于激活狀態(tài)，對(duì)應(yīng)紫外光譜分析，此時(shí)PO酶的紫外吸光度是增加的，說(shuō)明在這樣的Ba2+濃度下，酶結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化是有利于酶與底物的結(jié)合，提高了酶的活性；當(dāng)作用PO酶的Ba2+濃度為10-2和10-1mol/L時(shí)，PO酶的紫外吸光度低于對(duì)照組，可能是較高濃度的金屬離子促進(jìn)了酶蛋白的去折疊化，同時(shí)金屬離子加速了蛋白分子間的聚集，結(jié)果使一部分暴露于水環(huán)境的Trp和Tyr殘基又被包埋到疏水環(huán)境中。結(jié)合圖1分析，這種改變降低了酶與底物的結(jié)合，從而降低了酶的催化活性。

圖2 不同濃度Ba2+處理后的PO酶紫外吸收光譜變化

2.3 Ba2+對(duì)PO酶結(jié)構(gòu)的影響內(nèi)源熒光光譜分析

蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸具有熒光特性，而且極易受環(huán)境影響，所以蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度的變化可以間接反映出空間構(gòu)象的變化[13]。用波長(zhǎng)288 nm的激發(fā)光激發(fā)經(jīng)不同濃度的Ba2+作用的PO酶，結(jié)果見(jiàn)圖3。經(jīng)不同濃度Ba2+處理的PO酶在波長(zhǎng)337.8 nm處均出現(xiàn)了最高的發(fā)射峰。當(dāng)Ba2+濃度為0 mol/L時(shí)，PO酶熒光強(qiáng)度為734.283；當(dāng)Ba2+濃度為1×10-5mol/L，PO酶熒光強(qiáng)度上升至738.667；當(dāng)Ba2+濃度為1×10-4mol/L時(shí)，PO酶熒光強(qiáng)度為757.609；當(dāng)Ba2+濃度為1×10-2mol/L時(shí)，PO酶熒光強(qiáng)度開(kāi)始減小，為702.352；當(dāng)Ba2+濃度為1×10-1mol/L時(shí)，PO酶熒光強(qiáng)度為689.638?？梢钥闯?，隨著與PO酶作用的Ba2+濃度的逐漸增加，PO酶熒光強(qiáng)度的變化趨勢(shì)為先增大后減小，一般情況下，極性環(huán)境能影響蛋白質(zhì)的生色團(tuán)基團(tuán)的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能級(jí)，從而減少激發(fā)態(tài)的能量，使發(fā)射譜發(fā)生紅移或藍(lán)移現(xiàn)象[14]。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，經(jīng)Ba2+處理，酚氧化酶的內(nèi)源熒光光譜并未發(fā)生紅移或藍(lán)移的現(xiàn)象，這一結(jié)果與2.2紫外光譜分析結(jié)果相一致，所以，根據(jù)這2個(gè)光譜學(xué)的分析，可以推測(cè)Ba2+處理后的PO酶三級(jí)結(jié)構(gòu)變化很小。

圖3 不同濃度Ba2+處理后的PO酶熒光強(qiáng)度變化

2.4 Ba2+對(duì)PO酶結(jié)構(gòu)的影響紅外光譜分析

FTIR光譜儀在研究蛋白質(zhì)和多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)中越來(lái)越重要，尤其對(duì)于檢測(cè)非結(jié)晶態(tài)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)非常重要[15]；在實(shí)際應(yīng)用中，經(jīng)常利用酰胺Ⅰ帶和Ⅲ帶來(lái)研究蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)[16]，此次試驗(yàn)選取酰胺Ⅲ帶（1 220～1 330 cm-1）波段圖譜進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析。從圖4（A）中可以看出，酚氧化酶在經(jīng)過(guò)不同濃度的Ba2+處理后，在酰胺Ⅰ帶1 650 cm-1附近的峰，發(fā)生的強(qiáng)度變化很小，峰位也未發(fā)生位移。酰胺Ⅲ帶主要是C—N伸縮振動(dòng)和N—H彎曲振動(dòng)，Ba2+處理前后的PO酶在酰胺Ⅲ帶特征峰的強(qiáng)度和峰型均有變化，見(jiàn)圖4（B），對(duì)照組在1 300 cm-1和1 250 cm-1位置形成兩個(gè)峰；1×10-5mol/L的Ba2+處理的PO酶的紅外酰胺Ⅲ帶特征峰的峰型與對(duì)照組基本一致，1 250 cm-1位置強(qiáng)度增加；1×10-4，1×10-2和1×10-1mol/L的Ba2+處理的PO酶在1 280 cm-1位置出現(xiàn)一個(gè)較明顯峰，在1 242 cm-1處出現(xiàn)了一個(gè)峰，與對(duì)照比較，原來(lái)的1 300 cm-1和1 250 cm-1位置的峰的強(qiáng)度明顯變小。酰胺Ⅲ帶各子峰的歸屬：1 330～1 290 cm-1為α-螺旋，1 250～1 220 cm-1為β-折疊，1 295～1 265 cm-1為β-轉(zhuǎn)角，1 270～ 1 245 cm-1為無(wú)規(guī)則卷曲[17-18]。結(jié)合圖4（B）初步可以得出，Ba2+作用后PO酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

圖4 不同濃度Ba2+離子處理后的PO酶紅外光譜圖

采用Peak Fitv 4.12對(duì)分別經(jīng)不同濃度Ba2+處理的PO酶紅外光譜酰胺Ⅲ帶進(jìn)行基線調(diào)整、去卷曲、二階求導(dǎo)、曲線擬合，經(jīng)多次擬合使殘差（r2）大于0.99，根據(jù)酰胺Ⅲ帶各子峰歸屬二級(jí)結(jié)構(gòu)類型，依據(jù)相應(yīng)吸收峰面積百分比得出相應(yīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1中可以看出，分別經(jīng)不同濃度Ba2+處理的南美白對(duì)蝦PO酶與未處理的PO酶相比，二級(jí)結(jié)構(gòu)空間構(gòu)象類型含量發(fā)生了變化，未處理的PO酶含有20.69%的α-螺旋，27.54%的β-折疊，22.52%的β-轉(zhuǎn)角和29.25%的無(wú)規(guī)則卷曲。經(jīng)1×10-5mol/L Ba2+處理的PO酶，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量比對(duì)照組增加，無(wú)規(guī)則卷曲和β-折疊含量減少。經(jīng)1×10-4mol/L Ba2+處理的PO酶，α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲含量比對(duì)照組減少，β-轉(zhuǎn)角和β-折疊含量比對(duì)照組增加，結(jié)合圖1可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)這2個(gè)濃度的Ba2+處理的PO酶活性是增加的。經(jīng)1×10-2和1×10-1mol/L Ba2+處理的PO酶，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和β-折疊含量比對(duì)照組高，無(wú)規(guī)則卷曲含量比對(duì)照組低，結(jié)合圖1可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)這2個(gè)濃度的Ba2+處理的PO酶活性是降低的。在蛋白質(zhì)中，α-螺旋和β-折疊一般不是酶的活性中心，也不是配體以及底物的結(jié)合中心，主要是穩(wěn)定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的[17]，從表1中可以看出，經(jīng)Ba2+處理的PO酶的α-螺旋和β-折疊均發(fā)生了變化，說(shuō)明PO酶的空間構(gòu)象發(fā)生了變化，趨向不穩(wěn)定狀態(tài)變化，結(jié)合圖1結(jié)果，分別經(jīng)10-5和10-4mol/L的Ba2+處理的PO酶活性是增加的，說(shuō)明這種變化在最初的時(shí)候是有利于酶與底物的結(jié)合，對(duì)酶具有激活作用，其原因可能是適當(dāng)濃度的金屬離子的加入，使得酶與金屬離子間發(fā)生水合作用，增加了酶與底物間的接觸面積，增加了底物進(jìn)入到酶活性中心的機(jī)會(huì)，所以酶活性增加。隨著B(niǎo)a2+濃度的增加，PO酶肽鏈上的側(cè)鏈氨基酸展開(kāi)，酶分子間容易發(fā)生聚集，活性中心被包埋，影響底物與酶之間的結(jié)合，最終導(dǎo)致酶活性降低。

表1 不同濃度Ba2+處理的酚氧化酶二級(jí)結(jié)構(gòu)含量

3 結(jié)論

此次試驗(yàn)研究了Ba2+對(duì)南美白對(duì)蝦酚氧化酶活性和結(jié)構(gòu)的影響，隨著B(niǎo)a2+濃度的不斷增加，酚氧化酶的活性呈先增加后減小的趨勢(shì)。紫外光譜、熒光光譜研究表明，Ba2+使PO酶的紫外光譜和熒光光譜均發(fā)生了改變，但內(nèi)源熒光光譜最大發(fā)射波長(zhǎng)并未發(fā)生移動(dòng)現(xiàn)象，說(shuō)明Ba2+對(duì)PO酶三級(jí)結(jié)構(gòu)影響比較小。紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)，Ba2+使PO酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)空間構(gòu)象類型、含量均發(fā)生了變化，α-螺旋和β-折疊的變化可以說(shuō)明PO酶的空間構(gòu)象發(fā)生了變化，趨向不穩(wěn)定狀態(tài)變化，低濃度的Ba2+使PO酶發(fā)生的這種變化，對(duì)酶具有激活作用；隨著B(niǎo)a2+濃度的增加，PO酶活性開(kāi)始降低。