尹佳，胡金德，王麗華，鄧明慧，黃志鴻，李繼鋒

吉林化工學院生物與食品工程學院（吉林 132022）

葡萄籽占鮮果質量的4%～7%，其含有豐富的脂類、多酚類和蛋白質類化學物質，具有抗腫瘤、抗氧化、抗輻射和保護心血管等藥理學活性功能[1]。葡萄籽中存在可觀的葡萄籽蛋白，與葡萄籽蛋白相比，葡萄籽多肽具有更高的營養(yǎng)價值，具有抗氧化性、乳化穩(wěn)定性、抑菌性、免疫調節(jié)以及抗腫瘤等多種活性[2-3]。因而，研究葡萄籽多肽及其生物活性，既能提升葡萄籽蛋白質資源利用價值，也能增加食品的多樣化。

此次試驗選取木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶對葡萄籽蛋白進行酶解，通過單因素試驗，利用正交試驗分析方法，以葡萄籽多肽得率為響應優(yōu)化值，確定最佳工藝參數(shù)。根據(jù)清除DPPH自由基的能力和對鐵離子還原能力的測定，分析葡萄多肽的抗氧化活性。多肽是葡萄籽重要的活性成分之一，建立經濟有效的葡萄籽多肽提取方法，可為其應用于保健食品、生物制劑及醫(yī)藥品等相關產品的研發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄籽蛋白粉（實驗室自制）[4]、堿性蛋白酶（＞200 U/mg）、木瓜蛋白酶（＞600 U/mg）、考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白（BSA）、DPPH（1,1-diphenyl-1-picrylhydrazyl）、95%乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯乙酸、鐵氰化鉀、氯化鐵，以上試劑均為國產分析純。

JA-503分析電子天平（天津精拓儀器設備有限公司）；DDL-5M離心機（濟南博鑫生物技術有限公司）；HWS-24電熱恒溫水浴鍋（上海一恒儀器設備有限公司）；PSH-25型酸度計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；PR-5旋轉蒸發(fā)器（南通普瑞科技儀器有限公司）；UV-1800紫外分光光度計（上海奧析科學儀器有限公司）；FD-2A真空冷凍干燥機（上海繼普儀器制造有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 葡萄籽多肽的制備[5]

葡萄籽蛋白粉→溶解加熱（75 ℃，45 min）→葡萄籽蛋白溶液→調節(jié)pH→加酶→酶解液滅酶（90℃，20 min）→離心（4 000 r/min，20 min）→真空冷凍干燥→多肽凍干粉

1.2.2 單因素試驗

根據(jù)相關研究報道，蛋白酶解過程受復合酶的配比、酶的添加量、酶解時間、酶解溫度、酶解pH的影響[6-7]。因此，考察復合酶的配比（堿性蛋白酶-木瓜蛋白酶1∶4，2∶3，1∶1，3∶2和4∶1）、酶的添加量（酶底質量百分比1%，1.5%，2%，2.5%和3%）、酶解時間（1，2，3，4和5 h）、酶解溫度（45，50，55，60和65 ℃）、酶解pH（6.5，7.0，7.5，8.0和8.5）對葡萄籽多肽得率的影響，分別進行單因素試驗，以確定最佳的因素水平。

1.2.3 酶解液中總蛋白含量測定

參照祝婧等[8]方法。取1 mL酶解上清液于10 mL試管中，再加入5.0 mL 0.01%考馬斯亮藍G-250染液；空白組用蒸餾水作對照，混合均勻，靜置5 min，在595 nm波長下測定酶解液的吸光度；以牛血清白蛋白為標準品繪制標準曲線（圖1），根據(jù)標準曲線得到酶解液中總蛋白質含量?；貧w方程為y=0.084 1x+0.000 8（R2=0.997 5），線性關系良好。

圖1 牛血清白蛋白標準曲線

1.2.4 肽得率的測定

參照王雪峰等[9]方法。取5 mL酶解上清液測定其蛋白質含量；另取5 mL酶解上清液，加入5 mL 20%三氯乙酸溶液，搖勻，靜置30 min，以4 000 r/min離心20 min，取上清液測定肽得率。

1.2.5 多肽清除DPPH·清除能力測定[10]

配制濃度為0.1 mmol/L的DPPH·乙醇溶液與不同濃度梯度的多肽溶液；分別量取2 mL多肽溶液，與2 mL DPPH·乙醇溶液混合均勻，之后在避光處靜置30 min；在517 nm波長下測定混合溶液的吸光度，并按式（2）計算DPPH·清除率。

式中：A1為DPPH·乙醇溶液+葡萄籽多肽液的吸光度；A2為95%乙醇+葡萄籽多肽液的吸光度；A3為DPPH·+蒸餾水的吸光度。

1.2.6 多肽對鐵離子還原能力的測定[11]

取一定量的葡萄籽多肽，加入3.5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.6）、2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混合均勻，在50 ℃水浴中反應25 min。再各自加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻后于4 000 r/min離心10 min。取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%FeCl3溶液，混勻，靜置10 min，在700 nm波長處測定吸光度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 復合酶的配比對肽得率的影響

由圖2可知，當復合酶的質量比為堿性蛋白酶-木瓜蛋白酶3∶2時，蛋白多肽得率達到67.38%，當加入復合酶時，蛋白多肽被分解為相對分子質量更小的多肽和氨基酸，因此效果最佳[12]。

2.1.2 酶添加量對肽得率的影響

由圖3可知，蛋白發(fā)生酶解時隨著酶添加量的增加，多肽得率呈增加趨勢。當加酶量達到2.5%時，多肽得率增加趨緩。這是因為底物與酶的接觸面積趨于飽和，再增加酶用量反而由于大分子之間的位阻等作用抑制了酶促反應的進行[13]。因此最佳酶添加量為2.5%，這樣既不增加復合酶用量成本，又可使葡萄籽蛋白充分水解。

2.1.3 酶解時間對肽得率的影響

由圖4可知，肽得率隨時間的延長呈現(xiàn)先逐漸增加，再趨于平穩(wěn)后略有下降趨勢。在酶解4 h時，肽得率達到最大。當反應繼續(xù)進行時，肽得率逐漸平緩。這是由于隨著酶解時間的延長，酶解反應中蛋白底物被水解得比較徹底，之后酶解時間繼續(xù)增加而肽含量并未增加，因此肽得率趨于穩(wěn)定[14]。故最佳酶解時間選擇4 h。

圖4 酶解時間對肽得率的影響

2.1.4 酶解pH對肽得率的影響

由圖5可知，隨著pH的增大，酶解反應速率在增大，肽的含量也在增多，當pH增加至7.5時，肽得率達最大值，隨后則隨著pH持續(xù)增加，肽得率下降。這是因為在酶解反應中，每種酶促反應均會有最適pH，過酸或過堿的環(huán)境均會使酶的活性下降，影響反應速率[15]。因此，最適酶解pH為7.5。

圖5 酶解pH對肽得率的影響

2.1.5 酶解溫度對多肽含量的影響

由圖6可知，隨著酶解溫度的不斷升高，多肽得率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。這是因為隨著溫度的升高，酶活性慢慢增大，酶解的多肽產物增多，肽得率隨之增大[16]。但是當溫度過高時，酶活性會大大降低，因此酶解的多肽產物減少，肽得率下降。故最佳酶解溫度選擇50 ℃。

圖6 酶解溫度對肽得率的影響

2.2 正交試驗優(yōu)化酶解制備工藝

根據(jù)單因素試驗結果，選定酶解溫度（A）、酶添加量（B）、酶解時間（C）、酶解pH（D）為自變量，肽得率為響應值，采用L9(34)正交試驗對酶解條件進行優(yōu)化，結果見表1和表2。

由極差R可知，影響葡萄籽多肽得率的各因素主次順序為A＞C＞B＞D。因此，酶解溫度對葡萄籽多肽得率的影響最大。根據(jù)各試驗因子的平均數(shù)可知，蛋白酶解的最佳組合為A2B2C3D2，即酶解溫度50 ℃，酶添加量2.5%，酶解時間5 h，pH 7.5，此時葡萄籽多肽的得率最高。在此最優(yōu)工藝條件下分別進行3次葡萄籽蛋白酶解試驗，葡萄籽多肽得率為78.64%。

2.3 葡萄籽多肽的抗氧化活性

將多肽樣品稀釋成不同質量濃度進行多肽清除DPPH自由基能力和多肽對鐵離子還原能力的測定，結果如圖7所示。多肽對DPPH自由基的清除具有一定的作用，在質量濃度0.1～1 mg/mL范圍內，多肽對自由基的清除能力隨著其濃度的增加而增強。在多肽對鐵離子還原能力的測定中，吸光度越大，說明還原力越強，抗氧化活性就越高[17]。由圖7可知，隨著多肽質量濃度的增大，其還原能力隨之增強，所以葡萄籽多肽具有良好的體外抗氧化活性，且與其濃度具有依賴關系。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗結果表

圖7 質量濃度與抗氧化活性的關系

3 結論

此次試驗以葡萄籽蛋白粉為原料，考察復合酶的質量比、酶解溫度、酶的添加量、酶解時間及酶解pH對多肽得率的影響，并結合正交試驗優(yōu)化了酶法制備葡萄籽多肽的最優(yōu)工藝條件：pH 7.5，酶解時間5 h，酶添加量2.5%，酶解溫度50 ℃，堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶質量比3∶2。在此條件下，葡萄籽多肽得率為78.64%。葡萄籽多肽具有良好的體外抗氧化活性，且與其濃度具有依賴關系。此次試驗為葡萄籽蛋白活性肽的高效制備及抗菌肽等高附加值產品的研發(fā)提供理論依據(jù)。