方磊，王雨辰，張海欣，馬勇，谷瑞增，陳亮

中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心（北京 100015）

生物活性肽是指對生物機體的生命活動有益或具有生理作用的肽類化合物，又稱功能肽。功能肽一般是由相應(yīng)的蛋白通過酶解制得，通常含有3～20個氨基酸殘基，它在原蛋白質(zhì)序列上沒有生物活性，但是通過酸、堿或酶水解釋放后具有生物活性，其活性取決于它們的氨基酸組成及其排列順序[1]。據(jù)報道已經(jīng)開發(fā)出多種具有抗氧化、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等生物活性肽[2-4]，在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域展現(xiàn)出極好的應(yīng)用前景。南極磷蝦（Euphausia superba），又名大磷蝦或南極大磷蝦，是一種生活在南冰洋的南極洲水域的磷蝦。南極磷蝦是世界上生物量最大的多細(xì)胞生物，據(jù)統(tǒng)計南極磷蝦資源的生物量保守估算有6.5億～10億 t，每年的可捕量為6 500萬～1億 t，等同于全球1年的總海洋捕撈產(chǎn)量[5]。南極磷蝦含有豐富的蛋白質(zhì)，其干基蛋白質(zhì)含量為60%～80%，是世界上最大的動物蛋白資源庫，南極磷蝦蛋白的營養(yǎng)價值比牛肉和對蝦還要高，研究表明南極磷蝦含有豐富的氨基酸組成，其中谷氨酸含量最高。磷蝦蛋白具有良好的開發(fā)利用價值，已經(jīng)被開發(fā)為功能蛋白濃縮物[6]。南極磷蝦酶解液具有巨大的開發(fā)應(yīng)用潛力，是一種良好的磷蝦蛋白利用方式，但是南極磷蝦深度酶解過程伴隨著氟的釋放，使得酶解液氟含量過高。人們在大量攝入時，很可能會導(dǎo)致氟攝入量超出安全限量，對其安全構(gòu)成潛在的威脅，不利于磷蝦的開發(fā)利用。為了更好地開發(fā)利用南極磷蝦，有必要對酶解液進(jìn)行脫氟處理，降低其氟含量[7]。

目前，關(guān)于南極磷蝦肽的抗氧化功能活性研究鮮有報道，此次試驗以南極磷蝦為試驗對象，通過單因素試驗和正交試驗對酶解液進(jìn)行脫氟，然后對最適條件下的酶解液從多個方面評價其抗氧化功能活性，為南極磷蝦的應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)和應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、設(shè)備與儀器

南極磷蝦粉，自制；抗壞血酸VC、鄰苯三酚、三氯乙酸，美國Sigma公司；乙腈、三氟乙酸，英國Alfa Aesar公司；Ca(OH)2、乙酸、硼酸、鹽酸，北京化工廠；木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶，諾維信生物技術(shù)有限公司。

SY21-KP4恒溫水浴箱，北京市長風(fēng)儀器儀表公司；AB104-N電子天平，梅特勒托利多公司；LC-20A高效液相色譜儀，日本Shimadzu公司；3K-15型冷凍離心機，德國Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 脫氟南極磷蝦肽的制備

原料南極磷蝦粉→勻漿→稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.5→超聲水洗→離心取渣→加水?dāng)嚢琛鶱aOH調(diào)pH至7→酶解4 h→Ca(OH)2脫氟→離心取上清→冷凍干燥

單因素試驗包括超聲水洗時間、Ca(OH)2添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間。超聲時間對脫氟的影響試驗：超聲水洗時間分別設(shè)為5，10，15，20和25 min，Ca(OH)2添加量1%（按體積計），溫度40 ℃，反應(yīng)時間60 min；Ca(OH)2添加量對脫氟的影響試驗：超聲水洗時間20 min，Ca(OH)2添加量分別設(shè)為0.2%，0.4%，0.6%，0.8%和1%（按體積計），溫度40 ℃，反應(yīng)時間60 min；反應(yīng)溫度對脫氟的影響試驗：超聲水洗時間20 min，Ca(OH)2添加量0.6%，溫度分別設(shè)為20，30，40，50和60 ℃，反應(yīng)時間60 min；反應(yīng)時間對脫氟的影響試驗：超聲水洗時間20 min，Ca(OH)2添加量0.6%，溫度40 ℃，反應(yīng)時間分別設(shè)為15，30，45，60和75 min。

在單因素試驗基礎(chǔ)上確定正交試驗的因素及水平，選用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗，試驗設(shè)計見表1。確定最佳的南極磷蝦肽的脫氟制備工藝，南極磷蝦粉經(jīng)檢測氟含量為227 mg/kg。

表1 正交試驗設(shè)計表

1.2.2 南極磷蝦肽的氨基酸和分子量分布測定

依據(jù)GB 5009.124[8]，采用L-8900日立全自動氨基酸分析儀對南極磷蝦肽中的氨基酸組成進(jìn)行測定；將樣品用流動相溶解后并經(jīng)孔徑0.2 μm聚四氟乙烯過濾膜過濾，然后通過高效液相色譜儀進(jìn)行凝膠過濾，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品的分子量分布。

1.2.3 南極磷蝦肽的抗氧化活性測定

南極磷蝦肽的抗氧化活性從4個方面體現(xiàn)，其中包括DPPH·自由基清除能力測定[9]、羥自由基（·OH）清除能力測定[10]、超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力測定[11]以及還原能力測定[12]。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Origin 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，采用單因素方差分析，若t檢驗，p＜0.05，則證明數(shù)據(jù)差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 南極磷蝦肽脫氟的單因素試驗

由圖1（A）可知，隨著水洗時間的延長，南極磷蝦酶解液的氟含量呈先下降后升高的趨勢。當(dāng)超聲水洗時間為5～20 min時，南極磷蝦肽酶解液的氟含量依次降低，隨著時間的延長，南極磷蝦肽酶解液中更多的氟被溶出，使得氟含量降低；但當(dāng)水洗時間為25 min時，氟含量反而升高，原因可能是超聲時間延長導(dǎo)致酶解液中以非離子形式存在的氟更多地被溶出，因此超聲水洗時間20 min比較合適，選擇此時間作為后續(xù)試驗條件。

由圖1（B）可知，隨著Ca(OH)2添加量的增加，氟含量呈下降趨勢。當(dāng)添加量為0.2%時，酶解液氟含量為59.28 mg/kg。當(dāng)添加量為0.2%～0.6%之間時，隨著添加量的增加，酶解液氟含量呈急劇下降趨勢。當(dāng)添加量為0.6%時，酶解液氟含量僅為42 mg/kg。當(dāng)添加量超過0.6%時，酶解液氟含量降低并不明顯。因此選擇0.6%作為Ca(OH)2最適添加量。

由圖1（C）可知，在20 ℃條件下，酶解液氟含量為65.01 mg/kg。當(dāng)反應(yīng)溫度提高到40 ℃時，酶解液氟含量明顯降低至43.09 mg/kg。隨著溫度的進(jìn)一步提高，酶解液氟含量降低趨勢不明顯；當(dāng)反應(yīng)溫度為50 ℃時反而略有上升。過高的反應(yīng)溫度可能會對酶解液的營養(yǎng)價值造成損失，故選擇40 ℃作為反應(yīng)的最適溫度。

由圖1（D）可知，反應(yīng)15 min后就已有脫氟效果，此時酶解液的氟含量為44.98 mg/kg。隨著反應(yīng)時間的進(jìn)行，脫氟效果較好，氟含量呈現(xiàn)降低的趨勢。當(dāng)反應(yīng)時間為60 min時，酶解液的氟含量僅為27.91 mg/kg。當(dāng)反應(yīng)時間增加到75 min時，脫氟效果反而略有下降。為避免脫氟時間過長造成成本浪費，同時考慮脫氟效果，故選擇60 min作為反應(yīng)的最適時間。

圖1 單因素試驗結(jié)果

2.2 南極磷蝦肽脫氟的正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對超聲水洗時間、Ca(OH)2添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間4個因素進(jìn)行L9(34)正交試驗，結(jié)果見表2。影響南極磷蝦酶解液脫氟的因素主次順序是D＞B＞A＞C，即反應(yīng)時間＞Ca(OH)2添加量＞超聲水洗時間＞反應(yīng)溫度；最佳試驗方案是D2B2A2C2，即反應(yīng)時間60 min、Ca(OH)2添加量0.6%、超聲水洗時間20 min、反應(yīng)溫度40 ℃，在此條件下脫氟效果最好，酶解液氟含量僅為24.78%±0.56%，較南極磷蝦粉氟含量降低89.08%。

表2 正交試驗結(jié)果

2.3 南極磷蝦肽的相對分子質(zhì)量和氨基酸組成測定

表3表明，南極磷蝦肽的相對分子質(zhì)量小于1 000 U的組分高達(dá)93.233%，其中500～1 000 U的組分占21.160%，140～500 U的組分占68.263%。研究表明，小分子肽的吸收效率比氨基酸高，更容易被人體吸收利用，進(jìn)而發(fā)揮其多種功能活性。據(jù)報道，肽的抗氧化活性與其相對分子質(zhì)量有關(guān)，而低分子量肽與DPPH·清除活性密切相關(guān)[13-15]?？傊吆康牡头肿恿侩倪M(jìn)一步增強了其抗氧化活性，為后續(xù)研究其活性奠定了基礎(chǔ)。

表3 南極磷蝦肽相對分子質(zhì)量分布情況

表4 南極磷蝦肽氨基酸含量 g/100 g

從表4可知，南極磷蝦肽氨基酸含量豐富，富含人體所需的8種必需氨基酸和2種半必需氨基酸（組氨酸和精氨酸），含量分別為29.402%和6.073%，占氨基酸總和的47.609%，具有較高的營養(yǎng)價值。據(jù)報道，肽的氨基酸組成對其抗氧化活性有重要的作用，例如疏水性氨基酸（亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）、芳香族氨基酸（色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸）、精氨酸、脯氨酸、半胱氨酸等[16-18]；南極磷蝦肽含有較高含量的亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸以及脯氨酸，因此南極磷蝦肽是一種潛在的抗氧化活性物質(zhì)。

2.4 南極磷蝦肽的體外抗氧化分析

2.4.1 南極磷蝦肽DPPH·清除能力

DPPH·是乙醇中穩(wěn)定的含N自由基，通常用于確定抗氧化化合物的給氫或清除自由基的能力，其吸光度與受試樣品的抗氧化性呈反比線性關(guān)系，因此DPPH·清除是體外研究抗氧化的一項重要指標(biāo)[19-20]。由圖2（A）可以看出，南極磷蝦肽在質(zhì)量濃度1～5 mg/mL范圍內(nèi)，南極磷蝦肽對DPPH·的清除能力近似隨質(zhì)量濃度的增加呈直線上升趨勢。當(dāng)南極磷蝦肽質(zhì)量濃度＞5 mg/mL時，DPPH·清除能力增加趨勢并不明顯；當(dāng)質(zhì)量濃度為25 mg/mL時，清除率達(dá)到97.75%；南極磷蝦肽清除DPPH·的IC50值為2.12 mg/mL?？箟难酼C是一種高效抗氧化劑，具有極強的DPPH·清除能力，其IC50值為4.5 μg/mL，雖然VC的抗氧化性能更強些，但是VC屬于單一的化學(xué)成分，而南極磷蝦肽屬于天然的功能活性物質(zhì)，服用安全性高；并且南極磷蝦肽濃度較高時同樣起到與VC相近的DPPH·清除作用。

2.4.2 南極磷蝦肽·OH清除能力

羥自由基（·OH）是活性氧中對人體毒性最大的一種自由基，能夠破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，造成機體損傷[21]。由圖2（B）可知，南極磷蝦肽質(zhì)量濃度在1～9 mg/mL范圍內(nèi)，·OH清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到9 mg/mL時，其·OH的清除率達(dá)到76.67%；南極磷蝦肽·OH清除的IC50值為5.72 mg/mL。陽性對照VC的IC50值為0.76 mg/mL，是南極磷蝦肽的7.53倍，但此次試驗測定得南極磷蝦肽的·OH清除能力要高于梁帥峰[22]測定的牡蠣肽（IC50=6.4 mg/mL）和趙玲等[23]測定的海參水煮液多肽（IC50=6.658 mg/mL）。

2.4.3 南極磷蝦肽O2-·清除能力

超氧陰離子自由基（O2-·）具有很強的氧化性和還原性，在細(xì)胞內(nèi)與羥基結(jié)合后會導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷；通常采用鄰苯三酚自氧化法測定抗氧化劑清除O2-·的能力[22,24]。如圖2（C）所示，南極磷蝦肽的O2-·清除活性呈濃度依賴性。此外，其清除O2-·的IC50值是16.43 mg/mL。陽性對照抗壞血酸VC的IC50值是0.04 mg/mL，具有很強的清除能力，約是南極磷蝦肽的410倍。此次試驗測定的南極磷蝦肽清除·的IC50值要低于韓道才[25]用Alcalase蛋白酶水解出的羅非魚酶解液（IC50=12.47 mg/mL），卻高于于婭等[26]用Alcalase堿性蛋白酶制備的牡蠣酶解液（IC50=23.00 mg/mL）。

圖2 南極磷蝦肽的抗氧化分析

2.4.4 南極磷蝦肽還原能力

還原力是評價物質(zhì)抗氧化能力強弱的重要指標(biāo)，試驗表明：南極磷蝦肽的吸光度隨著濃度的增加而增大，具有一定的濃度依賴性，表明南極磷蝦具有較強的還原能力。南極磷蝦肽可作為電子供體與自由基進(jìn)行反應(yīng)從而終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；此外，南極磷蝦的還原能力還與酶解后暴露出的氨基酸殘基可能有關(guān)，它們可能含有側(cè)鏈—OH 或能提供電子[24,27]。

3 結(jié)論

通過單因素試驗及正交試驗，確定南極磷蝦酶解液脫氟的適宜條件，即超聲水洗時間20 min、Ca(OH)2添加量0.6%、反應(yīng)溫度40 ℃、反應(yīng)時間60 min。在此條件下，酶解液的氟含量僅為24.78 mg/kg。南極磷蝦肽粉的分子量主要集中在1 000 U以下，尤其是140～500 U的分子量占比達(dá)68.263%；其氨基酸組成豐富；抗氧化試驗表明南極磷蝦肽具有較強的DPPH·、·OH、O2-·清除能力和較強的還原力，其清除DPPH·、·OH、O2-·的IC50值分別是2.12，5.72和16.43 mg/mL，說明南極磷蝦肽具有較好的抗氧化能力。因此，南極磷蝦肽可作為一種天然安全的抗氧化物質(zhì)，應(yīng)用于功能性食品、生物制藥及化妝品等領(lǐng)域。