羅海濤，何力，任周營，邵燈寅

江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心（南昌 330096）

甘草為豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch）、脹果甘草（Glycyrrhiza inflataBat）或光果甘草（Glycyrrhiza glabraL.）的干燥根及根莖[1]。是臨床常用、不可或缺的中藥材。主要用于脾胃虛弱，倦怠乏力，心悸氣短，咳嗽痰多，脘腹、四肢攣急疼痛，癰腫瘡毒，緩解藥物毒性、烈性[2]。甘草的主要活性成分包含甘草酸、甘草苷和異甘草素等[3]。其中，甘草酸具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗凝血、保肝、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)吸收等多種藥理活性[4-5]。甘草酸也是甘草甜味的有效成分，它的特點(diǎn)是高甜度、低熱能、安全無毒，起泡性和溶血性作用低。能與多種生物堿、抗生素、氨基酸等生成復(fù)鹽或復(fù)方制劑，具有協(xié)同、增溶、增加藥物穩(wěn)定性、提高生物利用率及降低毒副作用的功效；并廣泛用于食品添加劑、化妝品、煙草行業(yè)[6-7]。甘草制品包括甘草浸膏、甘草流浸膏、甘草粉及甘草酊等[7]，其在卷煙中應(yīng)用能柔和煙氣，潤喉增甜，降低對(duì)鼻腔、喉部、口腔黏膜的刺激。

適用于卷煙嘴棒加香的甘草產(chǎn)品研究較少。試驗(yàn)選用產(chǎn)地來自天然無污染的云南德欽藏地甘草作為主要天然植物資源，采用不同溶劑提取甘草提取物，采用超高效液相相色譜/光電二級(jí)陣列檢測(cè)器聯(lián)用儀測(cè)定提取物中的甘草酸，采用GC-MS分析致香成分，并對(duì)提取物在嘴棒中的應(yīng)用效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，為開發(fā)適合嘴棒使用、體現(xiàn)增甜增潤功效的甘草提取物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

5 L萃取釜（三艾斯玻璃儀器公司）；D2010W電動(dòng)攪拌器（馳久牌）；DLSK-30/30低溫冷卻液循環(huán)泵（鄭州科泰試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；HH-WO多功能水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；KQ-250DE型臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電子分析天平（梅特勒儀器有限公司）；中藥粉碎機(jī)（上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司）；超高效液相相色譜/光電二級(jí)陣列檢測(cè)器聯(lián)用儀（Waters UPLC I-Class-PDA）、樣品管理室、柱溫箱分別配有獨(dú)立可控溫單元（美國沃特世公司）；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配備自動(dòng)進(jìn)樣器，美國安捷倫公司）；高速離心機(jī)（賽默飛世爾公司）；Biocel型Millipore Mill-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；50 mL聚丙烯離心管。

甘草藥材（產(chǎn)自云南德欽，云南德欽有時(shí)遇見熊商貿(mào)有限公司）。

甲醇、乙腈（均為色譜純，美國TEDIA公司）；95%乙醇（食用級(jí)）、乙酸乙酯（分析純）（均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

甘草酸銨（純度≥98%，中國藥品生物制品檢定所）。

1.2 不同提取工藝

將藏地甘草原料以年份、含水量等指標(biāo)進(jìn)行分級(jí)整理，挑選合適等級(jí)甘草經(jīng)粉碎得甘草粗粉備用。參照《中國藥典》（一部）[2]，結(jié)合香料提取物制備的實(shí)用需求，按以下工藝進(jìn)行提取物樣品制備。

1.2.1 水提法

稱取500 g藏地甘草樣品，加入4倍水，加熱回流4 h，濾過，取濾液，減壓濃縮，即得藏地甘草水提物。

1.2.2 乙醇提取法

稱取500 g藏地甘草樣品，加入4倍95%乙醇，加熱回流4 h，濾過，取濾液，減壓濃縮，即得藏地甘草醇提物。

1.2.3 乙醇初提-乙酸乙酯復(fù)提

稱取500 g藏地甘草樣品，加入2 L 95%乙醇，回流提取4 h，濾過，取濾液，減壓濃縮，即得藏地甘草醇提物；取適量甘草醇提物，加入4倍乙酸乙酯，回流提取2 h，濾過，取濾液，減壓濃縮，即得藏地甘草精提物。

1.3 甘草酸測(cè)定方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液及流動(dòng)相配制

流動(dòng)相A，0.1%乙酸甲醇溶液；流動(dòng)相B，20 mmol/L醋酸銨，0.1%乙酸水溶液。

于10 mL容量瓶中，準(zhǔn)確稱取甘草酸銨5 mg，精確至0.1 mg，以流動(dòng)相A與流動(dòng)相B體積比65∶35定容，得到質(zhì)量濃度500 μg/mL的甘草酸銨儲(chǔ)備液（甘草酸質(zhì)量濃度489.8 μg/mL）。儲(chǔ)備液置于-4 ℃下保存，有效期3個(gè)月。

將儲(chǔ)備液分別以移液槍移取0.5，1.0，2.0，3.0和5.0 mL至10 mL容量瓶中，以流動(dòng)相A與流動(dòng)相B體積比65∶35定容，配制成甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度24.49，48.98，97.97，146.95和244.92 μg/mL的5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 色譜分析條件

色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱溫30 ℃，樣品管理室溫度5 ℃，強(qiáng)洗溶液采用甲醇，弱洗溶液采用甲醇與水體積比1∶9，進(jìn)樣量2 μ L，檢測(cè)器波長(zhǎng)250 nm，流速0.3 mL/min，梯度洗脫，分析時(shí)間8 min。梯度洗脫程序見表1。

1.3.3 檢測(cè)試液制備

分別稱取1.4.1制備的提取物樣品0.10 g于50 mL聚丙烯離心管中，加入50 mL流動(dòng)相（流動(dòng)相A與流動(dòng)相B體積比65∶35），超聲20 min，取上清液以0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后，經(jīng)超高效液相相色譜/光電二級(jí)陣列檢測(cè)器聯(lián)用儀檢測(cè)，外標(biāo)法定量分析。

1.4 GC-MS成分分析

1.4.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取0.5 g甘草提取物，加入250 μL 內(nèi)標(biāo)十七烷溶液和5.0 mL二氯甲烷，渦旋5 min，以5 000 r/min離心5 min，0.45 μm有機(jī)濾膜過濾，取1.0 mL待測(cè)。

1.4.2 儀器方法

色譜柱HP-INNOWAX（260 ℃，30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣量1.0 μL；分流模式分流比10∶1；恒流模式流量1.0 mL/min；升溫程序：40 ℃保留1 min，3 ℃/min升至250 ℃，保留10 min。電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150℃；溶劑延遲5 min；掃描范圍29～450 amu。

1.5 應(yīng)用效果評(píng)價(jià)

分別將1.4.1制備的甘草提取物，用微量注射器按每支0.5 μL添加至金圣（硬紅瑞香）嘴棒中，將注射好的煙支密封裝袋，放入恒溫22±1 ℃恒濕（相對(duì)濕度60%±2%）箱內(nèi)平衡48 h以上，由評(píng)吸人員進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品和供試樣品色譜圖

按照超高效液相色譜分離和分析條件，分別取甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液和甘草提取物供試樣品溶液，自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣2 μL，得色譜圖。分析結(jié)果如圖1所示，甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品出峰保留時(shí)間與甘草提取物樣品中甘草酸出峰保留時(shí)間基本一致，與相鄰色譜峰分離度好，無雜質(zhì)峰干擾，滿足甘草酸定量要求。

2.2 不同提取工藝提取物甘草酸含量

按甘草酸檢測(cè)試樣制備方法，分別取不同工藝制備的甘草提取物，制備測(cè)試溶液，經(jīng)超高效液相相色譜/光電二級(jí)陣列檢測(cè)器聯(lián)用儀檢測(cè)，測(cè)定甘草酸含量。結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示相對(duì)于水提法，乙醇提取所得提取物中甘草酸含量明顯較高，用乙酸乙酯對(duì)甘草醇提物進(jìn)行復(fù)提，可使甘草酸等有效成分進(jìn)一步富集，甘草酸含量最高。

2.3 致香成分分析

按GC-MS成分分析方法，分別對(duì)不同工藝制備的甘草提取物的致香成分進(jìn)行分析，香氣成分分析結(jié)果如表3所示。

如表3所示，甘草水提取的致香成分較少，主要為具有烘焙香的糖的裂解產(chǎn)物（糠醛、糠醇、5-羥甲基糠醛）、具有奶甜香的香蘭素及其衍生物，如高香草醇、香草酸；甘草經(jīng)醇提后進(jìn)一步用乙酸乙酯提取所得提取物物的香氣成分種類和總的香氣含量明顯增加，其中γ-丁內(nèi)酯、麥芽酚、呋喃酮、α-吡咯烷酮、香蘭素、油酸乙酯、亞油酸乙酯、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸等化合物的含量大幅增加。γ-丁內(nèi)酯、香蘭素可以增加奶甜香，麥芽酚可以增加焦甜香，呋喃酮可增加焦甜、菠蘿樣果甜香；高級(jí)脂肪酸及其酯類如亞油酸、亞麻酸、油酸乙酯、亞油酸乙酯等對(duì)香味沒有特別明顯的直接作用，但可以調(diào)節(jié)煙氣的酸堿度，使煙氣醇和，在降低煙氣粗糙感、改善口感等方面起重要作用。

圖1 甘草酸標(biāo)樣色譜圖（A）、甘草提取物和標(biāo)樣色譜對(duì)比圖（B）

表2 不同提取工藝制備提取物的甘草酸含量

表3 不同提取方式甘草提取物致香成分分析

接表3

2.4 不同提取工藝提取物在嘴棒中的應(yīng)用效果

分別將不同工藝制備的甘草提取物添加至卷煙嘴棒中，對(duì)其在卷煙嘴棒中的作用進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)結(jié)果如表4所示。

表4 不同工藝制備的甘草提取物在卷煙嘴棒中應(yīng)用效果評(píng)價(jià)

經(jīng)不同工藝所得的甘草提取物，在卷煙嘴棒中應(yīng)用，可不同程度增加甜香，提升香氣細(xì)膩圓潤性，增加口腔甜潤感。其中甘草水提物具有一定增甜效果，不過香氣質(zhì)感一般，微有雜氣，煙氣稍顯粗糙，造成甘草水提物感官質(zhì)量原因可能是：水提法在提取甘草中的甜味成分（甘草酸）等有效成分同時(shí)，部分大分子雜質(zhì)也被提取，這部分雜質(zhì)對(duì)香氣質(zhì)感會(huì)有影響，同時(shí)考慮到嘴棒用香原料多為脂溶性，因此水提法不適合嘴棒增甜劑的開發(fā)；甘草醇提物能增加甜香和甜味，一定程度上增加香氣圓潤和口腔的甜潤感。對(duì)醇提物用乙酸乙酯復(fù)提精制，伴隨著甘草酸等香味有效成分富集，所得提取物能夠明顯增加甜感，香氣質(zhì)感提升明顯，香氣細(xì)膩圓潤，口腔甜潤生津。感官評(píng)價(jià)結(jié)果與不同工藝制備甘草提取物中甘草酸含量及致香成分分析結(jié)果一致。結(jié)合甘草酸含量、致香成分分析和感官評(píng)價(jià)結(jié)果，可以判定采用乙醇初提-乙酸乙酯復(fù)提精制的工藝開發(fā)適合嘴棒添加的增甜增潤甘草提取物具有優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)論

采用超高效液相色譜法和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)不同提取工藝甘草提取物中甘草酸等甜香成分進(jìn)行分析，結(jié)果顯示采用乙醇初提-乙酸乙酯復(fù)提精制所得甘草提取物中甘草酸含量較高，達(dá)71.36 mg/g，且γ-丁內(nèi)酯、香蘭素、麥芽酚、呋喃酮等甜香成分較為豐富。該提取物在卷煙嘴棒中應(yīng)用能明顯增加甜感，香氣質(zhì)感提升明顯，香氣細(xì)膩圓潤，口腔甜潤生津。對(duì)藏地甘草采用乙醇粗提，乙酸乙酯復(fù)提精制的工藝開發(fā)嘴棒用甜潤劑具有較好應(yīng)用價(jià)值。