余芳 ，楊愛(ài)萍 ，石雪萍 ，葛偉麗，王嬌，蔣彩云

1. 江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院健康學(xué)院（南京 211168）；2. 江蘇省食品安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心（南京 211168）

辣木（Moringa oleiferaLam）為辣木科辣木屬植物，原產(chǎn)于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國(guó)云南、廣西等地區(qū)已有種植。辣木樹的葉子、豆莢和籽均可食用。辣木的種子辣木籽（Moringaseed）富含蛋白質(zhì)、油脂、多糖、礦物質(zhì)等，是一種新資源食品，具有一定的生理活性和藥用價(jià)值，常被用來(lái)預(yù)防和輔助治療糖尿病、高血壓、皮膚病、免疫力低下、關(guān)節(jié)炎等疾病[1-3]。辣木籽具有較高的抗氧化活性，可以清除自由基，常被用作抗動(dòng)脈粥樣硬化劑。彭曉云等[4]研究辣木精油的抗氧化活性，可清除果蠅體內(nèi)自由基。段瓊芬等[5]研究表明，光照時(shí)間、溫度和受熱時(shí)間均會(huì)對(duì)辣木籽抗氧化性產(chǎn)生影響。劉華勇等[6]采用水酶法獲得辣木籽抗氧化成分，通過(guò)測(cè)定DPPH消除能力評(píng)價(jià)其抗氧化活性。在非食品領(lǐng)域，辣木籽因其具有抗菌性和絮凝性而被運(yùn)用于凈化水源，李翀等[7]研究辣木籽蛋白對(duì)水中濁度的去除能力。

辣木多糖為辣木中重要成分之一，辣木不同器官的多糖含量變化范圍為8.16%～33.61%[8]。辣木籽多糖提取工藝研究中，多采用溶劑提取法。梁鵬等[9]研究表明，辣木籽所含多糖對(duì)于超氧陰離子自由基及羥自由基具有較好的清除作用，并隨著辣木籽多糖相對(duì)濃度增加而增加，充分體現(xiàn)辣木籽所具備的體外抗氧化活性。

試驗(yàn)以市售不同來(lái)源辣木籽為原料，分析其水分、灰分、蛋白質(zhì)、脂肪、多糖、礦物質(zhì)元素等營(yíng)養(yǎng)成分含量，優(yōu)選辣木籽，進(jìn)行辣木籽多糖提取工藝研究。采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)化辣木籽多糖提取工藝，選擇最佳提取工藝參數(shù)，為進(jìn)一步開發(fā)辣木籽資源，提取、分離、純化辣木籽多糖提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

辣木籽（市售；1號(hào)辣木籽顆粒飽滿，直徑10 mm×15 mm；2號(hào)辣木籽顆粒扁小，直徑約5 mm×8 mm；分別經(jīng)高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎后，密封儲(chǔ)存于冷凍冰箱中備用）。

Ca、K、Mg、Fe、Zn標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）；濃硝酸、濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、氫氧化鈉、苯酚、石油醚、無(wú)水乙醇、葡萄糖等（均為國(guó)產(chǎn)分析純）。

1.2 主要儀器及設(shè)備

FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；BSA224S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；101-2A電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；馬弗爐（杭州艾普儀器設(shè)備有限公司）；SHA-C電熱恒溫水浴鍋（上海路達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；Agilent 5110 ICP-OES電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（安捷倫科技公司）；SZ-1型快速混勻器（江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）；JH 722可見(jiàn)光分光光度計(jì)（上海菁華儀器儀表有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

水分測(cè)定采用直接干燥法（參照GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》第一法）；灰分測(cè)定采用直接灰化法（參照GB 5009.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》）；脂肪測(cè)定采用索氏提取法（參照GB 5009.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》第一法）；蛋白質(zhì)測(cè)定采用凱氏定氮法（參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》第一法）；多糖測(cè)定采用硫酸苯酚法[10]；礦質(zhì)元素測(cè)定采用GB 5009.268—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中多元素的測(cè)定》第一法 電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP-OES）。

1.3.2 辣木籽中多糖提取工藝單因素試驗(yàn)

稱取辣木籽粉末2 g，通過(guò)單因素試驗(yàn)，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)辣木籽多糖得率的影響。

1.3.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)

設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，50%，60%，70%和80%，料液比1∶30（g/mL），溫度60 ℃，浸提30 min，測(cè)定辣木籽多糖得率。

1.3.2.2 料液比

按照料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，溫度60 ℃，浸提30 min，測(cè)定辣木籽多糖得率。

1.3.2.3 提取溫度

設(shè)定提取溫度40，50，60，70和80 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶30（g/mL），浸提30 min，測(cè)定辣木籽多糖得率。

1.3.2.4 提取時(shí)間

浸提時(shí)間設(shè)定30，45，60，75和90 min，按照料液比1∶30（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，溫度60℃，測(cè)定辣木籽多糖得率。

1.3.3 辣木籽中多糖提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間及提取溫度作為4個(gè)考察因素，選取3個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)。采用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定提取最佳工藝。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

稱取105 ℃干燥至恒重的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖100.0 mg，置100 mL容量瓶中，加適量蒸餾水溶解，稀釋至刻度，搖勻。精密吸取10 mL，置100 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，每毫升含葡萄糖0.1 mg。分別精密取溶液0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6和1.8 mL，置于具塞試管中，分別加水至2.0 mL，各加入5%苯酚溶液1.0 mL搖勻，迅速加入硫酸5.0 mL搖勻，放置10 min，置沸水浴中加熱15 min，取出，迅速冷卻至室溫，可見(jiàn)分光光度計(jì)490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，空白對(duì)照以2.0 mL蒸餾水代替葡萄糖溶液。以吸光度（X）為橫坐標(biāo)、濃度（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

測(cè)定結(jié)果均平行重復(fù)3次，取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木籽營(yíng)養(yǎng)成分含量

由表2可知，顆粒飽滿、直徑大的1號(hào)辣木籽蛋白質(zhì)含量為35.8%，多糖含量為19.1%，較顆粒不均且粒小的2號(hào)辣木籽高。樊建麟等[11]對(duì)云南元江縣辣木籽營(yíng)養(yǎng)成分的研究中，測(cè)得其蛋白質(zhì)含量為37.8%，粗脂肪含量為40.12%，總糖含量的9.75%，董成國(guó)[12]研究表明，辣木籽中可溶性總糖含量為20.31%。

表2 不同來(lái)源辣木籽營(yíng)養(yǎng)成分含量 g/100 g

2.2 礦物質(zhì)元素含量測(cè)定

測(cè)定辣木籽中Ca、K、Mg、Fe、Zn這5種礦物元素含量，結(jié)果如表3所示，辣木籽的礦物元素含量大小順序均為K＞Mg＞Ca＞Fe＞Zn。

辣木籽中含有豐富的礦物質(zhì)元素，其含量受生長(zhǎng)的土壤及水質(zhì)環(huán)境的影響，還與辣木的品種、產(chǎn)地及辣木籽的采集季節(jié)等有關(guān)。辣木籽所含大量元素還是微量元素均比較豐富，其大量元素含量由高到低為P＞K＞Mg＞Na＞Ca，其中，P含量最高，為1 262 mg/kg；其次是K，含量為1 026 mg/kg，Mg含量為495 mg/kg[11]。楊東順等[13]研究結(jié)果表明，辣木不同部位樣品均含有Fe、Zn、Mn、Cr和Se等微量元素。其中，F(xiàn)e平均含量最高，辣木籽殼中最高，辣木籽為最低。

表3 不同來(lái)源辣木籽礦物質(zhì)含量

2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=16.53x（x為葡萄糖質(zhì)量，y為吸光度），線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.999。辣木籽多糖溶液在此濃度范圍內(nèi)，與吸光度呈良好的線性關(guān)系。測(cè)定多糖含量時(shí)，將所測(cè)定得到的吸光度代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，即能夠計(jì)算出所測(cè)溶液的多糖含量。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 提取條件對(duì)得率的影響

2.4.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)得率的影響

圖2結(jié)果顯示，乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～80%范圍內(nèi)，辣木籽多糖的測(cè)定吸光度隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這是因?yàn)槎嗵侨芤旱娜芙舛入S著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大不斷增大。達(dá)到80%之后，辣木籽多糖的得率隨著溫度升高呈下降趨勢(shì)，得率不斷降低，因而選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，70%和80%作為正交試驗(yàn)的3個(gè)試驗(yàn)水平。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)得率的影響

2.4.2 料液比對(duì)得率的影響

由圖3結(jié)果可知，料液比1∶15（g/mL）時(shí)，吸光度最高，多糖得率最大。隨著料液比從1∶20（g/mL）開始，吸光度降低；1∶25時(shí)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而1∶30（g/mL）時(shí)又有所下降，料液比1∶30（g/mL）時(shí)之后，隨著料液比的降低，多糖得率也逐步下降。因此，選擇1∶15，1∶20和1∶25（g/mL）作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

圖3 料液比對(duì)得率的影響

2.4.3 提取溫度對(duì)得率的影響

圖4結(jié)果表明，在40～80 ℃范圍內(nèi)，辣木籽多糖得率隨著溫度升高呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，得率不斷增大。這是因?yàn)槿芤旱娜芙舛入S著溫度增加不斷增大。在70 ℃之后，辣木籽多糖得率隨著溫度升高呈下降趨勢(shì)，得率不斷降低，因而選擇60，70和80 ℃作為正交試驗(yàn)的3個(gè)試驗(yàn)水平。

圖4 提取溫度對(duì)得率的影響

2.4.4 提取時(shí)間對(duì)得率的影響

由圖5可知，提取時(shí)間在30～90 min內(nèi)，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，辣木籽中多糖得率隨之升高，75 min末接近最大值，可見(jiàn)反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，提取越充分。在90 min之后，辣木籽多糖得率有所下降。因此，選擇水提時(shí)間60，75和90 min作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取影響辣木籽多糖提取效果各因素中有意義的水平做正交試驗(yàn)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行極差分析，以確定最佳的提取條件。采用L9(34)正交試驗(yàn)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）、提取溫度（D）作為4個(gè)考察因素，選取3個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)。每一水平K1、K2、K3中最大的值所對(duì)應(yīng)的條件即為該因素對(duì)應(yīng)的最佳提取條件。由表4可以看出，提取辣木籽多糖的最佳工藝條件為A2B2C2D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶20（g/mL）、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間75 min。4個(gè)因素對(duì)辣木籽多糖得率的影響大小依次為B＞D＞C＞A，其中料液比B的提取作用最為顯著。

影響辣木籽多糖得率的主要因素有料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間和提取次數(shù)等。梁鵬等[9]以水溶劑提取法提取辣木中水溶性多糖，在浸提120 min、溫度80 ℃、料液比1∶20（g/mL）條件下，粗多糖得率可達(dá)5.66%?？寡趸宄饔玫陌霐?shù)抑制率（IC50）分別是7.252 8和2.501 1 mg/mL。董成國(guó)[12]采用傳統(tǒng)的水提醇沉法對(duì)辣木籽中多糖進(jìn)行提取，在單因素的基礎(chǔ)上采用三因素三水平的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳的工藝參數(shù)，即料液比1∶55.5（g/mL），提取時(shí)間1 h，提取溫度79 ℃，在此條件下，多糖得率達(dá)到14.11%。

圖5 提取時(shí)間對(duì)得率的影響

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

依據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，測(cè)定辣木籽營(yíng)養(yǎng)成分含量，顆粒飽滿、直徑大的1號(hào)辣木籽蛋白質(zhì)含量35.8%，多糖含量19.1%，辣木籽中5種礦物元素含量順序?yàn)镵＞Mg＞Ca＞Fe＞Zn。

采用L9(34)正交試驗(yàn)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）、提取溫度（D）作為4個(gè)考察因素，選取3個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)，得出辣木籽多糖提取工藝的最佳條件為A2B2C2D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶20（g/mL）、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間75 min，4個(gè)因素對(duì)辣木籽多糖得率的影響大小依次為B＞D＞C＞A。