鐘英英，周佳明，葉美鳳，何湘惠，邢韓寒，葉云

廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院（柳州 545006）

辣木為辣木科辣木屬多年生熱帶喬木，因其有辛辣味的根而得名[1]。辣木作為一種新開發(fā)利用的食品，其具有生長迅速、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點，具有廣闊的開發(fā)利用前景[2-3]。近年來，對辣木葉的綜合利用主要表現(xiàn)在辣木有效成分的提取及保健食品開發(fā)。

黃嘌呤氧化酶能催化氧化黃嘌呤和次黃嘌呤生成尿酸[4]，當(dāng)體內(nèi)尿酸濃度過高可能會引起高尿酸血癥進而引發(fā)痛風(fēng)[5]。黃嘌呤氧化酶抑制劑作為治療痛風(fēng)的最主要藥物具有良好的發(fā)展前景，它可以通過降低黃嘌呤氧化酶的活性，抑制尿酸的生成，進而減少尿酸在體內(nèi)的含量而達到治療痛風(fēng)的目的[6-7]。然而，市面上常用的黃嘌呤氧化酶抑制劑通常毒副作用較多，會引發(fā)藥疹、發(fā)熱、頭痛、肝臟損害及過敏等副反應(yīng)[8-9]，嚴重威脅人體健康。因此，開發(fā)天然無毒副作用安全的降尿酸藥物，成為重要研究方向。試驗通過探討辣木葉提取物對黃嘌呤氧化酶活性的抑制作用，為研究安全新型的降尿酸藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

將辣木葉洗凈、烘干、粉碎后過篩，置于陰涼干燥處密封保存?zhèn)溆谩?/p>

別嘌呤醇、黃嘌呤氧化酶（上海源葉生物科技有限公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 辣木葉提取單因素試驗

準確稱量1.000 g辣木葉細粉，于超聲波-微波協(xié)同萃取儀進行提取，固定超聲波、微波功率分別為50 W、200 W，改變時間（700，800，900，1 000和1 100 s）、乙醇體積分數(shù)（40%，50%，60%，70%和80%）、提取溫度（40，50，60，70和80 ℃）、料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL））4個因素的不同水平進行萃取。將所得提取液離心、濃縮得浸膏。配成40 mg/mL提取液，測定其抑制率。

1.2.2 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以黃嘌呤氧化酶的抑制率為指標，參考劉靜波等[10]試驗，設(shè)計L9(34)正交表，確定最佳提取條件。開展驗證試驗，重復(fù)3次，求RSD值。

1.2.3 黃嘌呤氧化酶活性抑制試驗

按照表1的順序加入藥品混合均勻，25 ℃水浴反應(yīng)1 min，終止反應(yīng)，290 nm測吸光度。提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制率（I）為：OD1～OD4分別為試驗1～4在290 nm測得的吸光度（第1個試管測得的OD值以第3個試管為空白對照測得；第2個試管的OD值以第4管為空白對照測得）。

表1 黃嘌呤氧化酶活性抑制試驗反應(yīng)體系

1.2.4 抑制常數(shù)的測定

在5 mL反應(yīng)體系中，黃嘌呤氧化酶酶液濃度固定為0.05 U/mL，底物黃嘌呤的濃度分別為0.3和0.6 mmol/L，測定不同濃度辣木葉提取物酶解的反應(yīng)初速度。以提取物濃度作橫坐標，反應(yīng)初速度的倒數(shù)1/V為縱坐標，作Dixon圖，求抑制常數(shù)Ki值。

1.2.5 抑制類型的測定

在5 mL反應(yīng)體系中，黃嘌呤氧化酶酶液濃度固定為0.05 U/mL，底物濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mmol/L。測定辣木葉提取物質(zhì)量濃度為0和5 mg/mL開始酶解的反應(yīng)初速度。以1/[S]為橫坐標，反應(yīng)速率的倒數(shù)1/V為縱坐標，作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，推斷出抑制類型。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乙醇體積分數(shù)提取所得提取物對黃嘌呤氧化酶活性抑制影響

由圖1可知，乙醇體積分數(shù)在40%～70%之間時，抑制率隨乙醇體積分數(shù)增大而逐漸變大；乙醇體積分數(shù)達到70%時，抑制率達到最大；乙醇體積分數(shù)超過70%后，抑制率隨乙醇體積分數(shù)增大呈下降趨勢。原因可能是乙醇溶液體積分數(shù)較低，不能把辣木葉中的有效成分完全提取出來，而乙醇溶液的體積分數(shù)過高可能導(dǎo)致細胞蛋白質(zhì)變性，從而妨礙乙醇向植物細胞滲透，影響有效成分的浸出，故抑制率下降。故選定最適乙醇體積分數(shù)范圍為60%～80%。

圖1 不同乙醇體積分數(shù)所得提取物對黃嘌呤氧化酶活性抑制影響

2.2 不同提取時間所得提取物對黃嘌呤氧化酶活性抑制影響

由圖2可知，抑制率隨提取時間呈現(xiàn)先上升再下降趨勢，提取時間900 s時抑制率達到最大。原因可能是提取時間過短，辣木葉中的有效成分未被完全提出來，從而導(dǎo)致抑制率隨著反應(yīng)時間延長呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。提取時間900 s時，辣木葉中有效成分基本被完全提取，故抑制率達到最大。繼續(xù)延長提取時間，提取出的有效抑制活性成分被破壞或被氧化分解，使得抑制率呈現(xiàn)下降趨勢。

圖2 不同提取時間提取所得提取物對黃嘌呤氧化酶活性抑制影響

2.3 不同料液比提取所得提取物對黃嘌呤氧化酶活性抑制影響

由圖3可知，料液比在1∶10～1∶40（g/mL）時，抑制率隨料液比增大而增大；料液比1∶40（g/mL）時，抑制率達到最大；料液比超過1∶40（g/mL）時，抑制率隨料液比增大逐漸下降。原因可能是料液比小于1∶40（g/mL）時，料液比及濃度梯度越大，有效成分溶出越多，抑制作用逐漸增強；當(dāng)料液比為1∶40（g/mL）時，有效成分可能被完全提出，抑制率達到最大，已達到平衡；達到平衡之后，再增大料液比，浸出物變化不明顯。

圖3 不同料液比提取所得提取物對黃嘌呤氧化酶活性抑制影響

2.4 不同溫度提取所得提取物對黃嘌呤氧化酶活性抑制影響

由圖4可知，提取溫度在40～70 ℃之間，溫度越高，抑制率越高；溫度達到70 ℃時，抑制率達到最大；在70～80 ℃范圍內(nèi)，抑制率隨提取溫度升高呈下降趨勢。原因可能是溫度在40～70 ℃范圍內(nèi)，溫度升高加快乙醇的冷凝回流，導(dǎo)致辣木葉有效成分的提取速率增加，提取效果明顯提高，故抑制率逐漸上升；提取溫度70 ℃時，有效成分可能被完全提取出，抑制率達到最大；提取溫度超過70 ℃時，提取物中有效活性成分被高溫氧化，導(dǎo)致提取效率降低，從而導(dǎo)致抑制率下降。

圖4 不同溫度提取所得提取物對黃嘌呤氧化酶活性抑制影響

2.5 正交試驗

根據(jù)單因素的結(jié)果，設(shè)計L9(34)正交表[11-12]，以提取液對黃嘌呤氧化酶的抑制率作為評價標準，進行正交試驗，正交設(shè)計如表2，結(jié)果如表3所示。

表2 正交設(shè)計因素水平表

表3 辣木葉提取物對黃嘌呤氧化酶活性抑制影響正交表

由表3可知，各因素的主次順序依次為B＞C＞A＞D，且最優(yōu)的組合為B2C2A2D2，在此條件下進行3次平行驗證試驗，平均抑制率為79.81%，RSD值為0.66%。

2.6 辣木葉提取物對黃嘌呤氧化酶的影響

2.6.1 抑制常數(shù)的測定

Ki值是表征辣木葉提取物對酶促反應(yīng)抑制效率的重要參數(shù)，該值越小，表明辣木葉提取物對該酶促反應(yīng)抑制效果好。由圖5可知，在底物濃度0.3 mmol/L和底物濃度0.6 mmol/L，改變提取物濃度，得出其對反應(yīng)速度的影響曲線交點橫坐標的絕對值為6.76，所以辣木葉乙醇提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制常數(shù)Ki=6.76 mg/mL。

圖5 辣木葉提取物的黃嘌呤氧化酶反應(yīng)Dixon

2.6.2 抑制類型的測定

存在有競爭性抑制劑時，Km’會增大，Vmax’不變。從圖6可以看出，辣木葉提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用符合競爭性抑制的特征。競爭性抑制作用是最為常見的一種抑制類型，往往是酶的底物類似物或者是反應(yīng)產(chǎn)物，競爭性抑制劑與酶的結(jié)合部位與底物與酶的結(jié)合部位相同。

通過和底物黃嘌呤競爭黃嘌呤氧化酶的結(jié)合部位，影響它們的正常結(jié)合，從而抑制黃嘌呤氧化酶的活性，進而減少尿酸的生成。提取物濃度變大時，其抑制率也將變大。

圖6 加辣木葉提取物后黃嘌呤氧化酶的Lineweaver-Burk圖

3 結(jié)論

采用超聲波輔助提取獲得辣木葉的乙醇提取物，在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行正交試驗優(yōu)化，即最佳工藝條件為：乙醇體積分數(shù)70%、提取時間900 s、提取溫度70 ℃、料液比1∶40（g/mL）。在此條件下，辣木葉提取物對黃嘌呤氧化酶活力的抑制率為79.81%。

辣木葉提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制類型為競爭性抑制，抑制常數(shù)Ki=6.76 mg/mL，半抑制濃度IC50=10.55 mg/mL。