施鍇云 ，楊波，李琴，楊光，益莎 ，賀亮*

1. 浙江省森林資源生物與化學(xué)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省林業(yè)科學(xué)研究院（杭州 310023）；2. 上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院（上海 200093）

阿拉伯半乳聚糖（AG）是一類具有高度支鏈的中性多糖，具有多種生物活性如抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等，有研究表明AG還具有調(diào)節(jié)腸道的功能[1]，在2002年時(shí)作為食品添加劑被美國(guó)FDA通過(guò)認(rèn)證[2]。AG的相對(duì)分子質(zhì)量約6.8×105Da，其結(jié)構(gòu)主要由半乳聚糖作為主鏈，阿拉伯糖作為其支鏈與半乳糖通過(guò)β-1, 3鍵或β-1, 6鍵連接[3]，但其相對(duì)分子質(zhì)量較大，只有將其分子鏈降解斷開，才能更好發(fā)揮其生物活性。

有研究表明，相較于未降解的多糖，經(jīng)過(guò)降解的多糖在抗氧化及免疫活性等方面都有顯著提高。朱振元等[4]采用酶解法等3種方法降解古尼蟲草菌絲體多糖，發(fā)現(xiàn)其抗氧化活性良好。張海蕓等[5]采用超聲輔助自由基法降解阿拉伯半乳聚糖，發(fā)現(xiàn)該多糖降解后比降解前在清除羥自由基和DPPH上有一定提高。劉露等[6]使用山藥低聚糖作為碳源加入到雙歧桿菌培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)可以提高雙歧桿菌的生長(zhǎng)速率。然而降解無(wú)法定向獲得所需相對(duì)分子質(zhì)量的低聚多糖，經(jīng)試驗(yàn)表明，降解后的阿拉伯低聚半乳糖呈非連續(xù)性分布，跨度在1×103～5×103Da[7]。另外葡萄糖、乳糖等小分子糖類會(huì)不同程度地包含在降解物中[8]，這種分布使得分離單一分子量的多糖有較大難度，從而對(duì)多糖后續(xù)的理化研究及結(jié)構(gòu)分析產(chǎn)生影響[9]。另一方面，傳統(tǒng)的柱層析法分離多糖雖具有操作條件溫和，可以保持分離成分理化性質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)[10]，但是層析速度慢，精度較低，需要大量洗脫劑，對(duì)資源和環(huán)境造成浪費(fèi)和污染，工業(yè)化難度較高。因此在多糖的提取和降解后，必然需要對(duì)多糖分離純化的方法進(jìn)行探索和優(yōu)化。超濾（UF）和納濾（NF）是熱門的新型膜分離技術(shù)[11]，該技術(shù)利用不同孔徑微孔濾膜，以膜組件兩側(cè)壓力差為推動(dòng)力，將不同質(zhì)量的溶質(zhì)進(jìn)行分離、分級(jí)或濃縮[12-13]。由于整個(gè)過(guò)程中沒(méi)有產(chǎn)生相變，節(jié)能環(huán)保，短時(shí)高效，成本低廉，在食品藥品行業(yè)中具有強(qiáng)勁的發(fā)展趨勢(shì)[14-15]。試驗(yàn)以阿拉伯半乳聚糖的降解液為原料，結(jié)合2種膜分離法，對(duì)阿拉伯低聚半乳糖的制備純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，利用體外試驗(yàn)研究阿拉伯低聚半乳糖對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，為實(shí)現(xiàn)功能性低聚多糖生產(chǎn)規(guī)模化、應(yīng)用集成化提供數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器與試劑

1.1.1 主要儀器

pH計(jì)（Sartorius PB-10）；臺(tái)式離心機(jī)（Neofuge 15）；電子天平（BSA224S）；85-2型磁力攪拌器（杭州儀表電機(jī)有限公司）；Biosafer SB25-12DT型超聲清洗儀（南京賽飛生物科技有限公司）；紫外分光光度計(jì)（北京高能科迪科技有限公司）；MZ2CNT真空泵（德國(guó)Vacumbrand）；多角度激光散射儀DAWN HELEOS II（賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）；小型切向流超濾系統(tǒng)（Millipore公司）。

1.1.2 主要試劑

阿拉伯半乳聚糖（百龍創(chuàng)園科技有限公司）；無(wú)水硫酸亞鐵、乙酸銅（國(guó)藥試劑集團(tuán)）；30%過(guò)氧化氫（杭州晶欣化工有限公司）；無(wú)水乙醇（上海穆百化工有限公司）；葡萄糖（天津巴斯夫化工有限公司）；硫酸（國(guó)藥試劑集團(tuán)）；苯酚（成都科龍化工試劑廠）；氫氧化鈉（國(guó)藥試劑集團(tuán)）；硝酸鈉（上海晶純生化科技股份有限公司）；Proclin300（西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）；Bio-5微孔濾膜（山東招金膜天有限責(zé)任公司）；陶氏NF270-4040納濾膜。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 阿拉伯低聚半乳糖的制備

參考張海蕓等[5]的方法并作出修改，用蒸餾水溶解阿拉伯半乳聚糖，使其質(zhì)量濃度為10 g/L，磁力攪拌溶解30 min。加入1 mmol/L乙酸銅，調(diào)節(jié)pH 6.0。加入體積分?jǐn)?shù)6% H2O2，混勻并置入提前以60 ℃預(yù)熱好的超聲儀器中（功率600 W）。打開超聲儀并不斷攪拌60 min后，加入0.6 g/100 mL NaHSO3終止降解反應(yīng)。過(guò)0.45 μm微孔濾膜濾去雜質(zhì)，即得阿拉伯低聚半乳糖，將其命名為Oligo-AG。

1.2.2 膜分離工藝流程

采用切向流超濾系統(tǒng)（TFF）（見圖1）。操作流程為樣品溶液經(jīng)調(diào)速泵流入膜分離組件，以切向流通過(guò)膜組件，壓力差為驅(qū)動(dòng)力，從膜分離柱外腔透過(guò)口流出的為透過(guò)液，從回流口流回樣品槽的為截留液。

圖1 膜分離工藝流程

1.2.3 超濾運(yùn)行參數(shù)優(yōu)化

為確定超濾膜運(yùn)行的最佳參數(shù)，在25 ℃條件下，探究以O(shè)ligo-AG為進(jìn)料液時(shí)，不同稀釋倍數(shù)對(duì)超濾膜截留性能的影響；稀釋倍數(shù)1∶5時(shí)，不同操作壓力對(duì)超濾膜截留性能的影響；稀釋倍數(shù)為1∶5時(shí)，操作壓力0.2 MPa時(shí)，不同料液溫度對(duì)超濾膜截留性能的影響。

1.2.4 多糖含量的測(cè)定

分別各5 mL截留液和透過(guò)液，加入20 mL無(wú)水乙醇，于4 ℃醇沉12 h，以5 000 r/min離心15 min后，棄上清，將沉淀用蒸餾水復(fù)溶，并用100 mL容量瓶定容，采用苯酚-硫酸法[16]測(cè)定多糖含量。以未超濾的多糖降解液為對(duì)照組。

1.2.5 降解液中阿拉伯低聚半乳糖的分子量分布測(cè)定

參考王一寓等[17]的方法并做出一定修改，采用高效凝膠過(guò)濾色譜-多角度激光散射法（HPSEC-MALLS）對(duì)多糖的純度、重均分子量等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.2.5.1 樣品溶液配制

配置含有0.02% Proclin 300的超純水、過(guò)2層0.22 μm微孔濾膜的超純水；將5 mg/mL樣品溶解到已經(jīng)配制好的超純水中；用磁力攪拌器以適宜的溫度和轉(zhuǎn)速不斷攪拌助溶12 h后，過(guò)0.22 μm濾膜。

1.2.5.2 樣品檢測(cè)條件

用含有0.02% Proclin300的超純水進(jìn)行配制0.1 mol/L硝酸鈉溶液作為流動(dòng)相，過(guò)0.22 μm濾膜。

打開檢測(cè)軟件（ASTRA version 5.3.4），設(shè)置折光率增量dn/dc為0.138 0 mL/g，運(yùn)行時(shí)間60 min，采用100 μL樣品環(huán)上樣，流速0.5 mL/min，將TSK gelG 5000PWXL（30 cm×730 cm×7.8 mm ID×10 μm）和TSK gel G 3000PWXL（30 cm×7.8 mm ID×6 μm）進(jìn)行串聯(lián)，并在串聯(lián)柱安裝前連接上保護(hù)柱 TSK PWXLGuard Column（7.5 cm×7.5 mm ID），柱溫25 ℃，待激光信號(hào)穩(wěn)定后即可進(jìn)樣。

1.2.6 評(píng)價(jià)指標(biāo)

超濾膜衰減通量（σ）、溶質(zhì)透過(guò)因子（P）、表觀截留率（R）和超濾膜多糖回收率（Wr）計(jì)算如式（1）～（4）。

式中：ft和f0分別是過(guò)濾時(shí)間在t和0時(shí)刻的滲透液通量，L/（m2·h）；CP和C0分別是原液和透過(guò)液中Oligo-AG濃度，g/L；CP2和VP2分別是超濾時(shí)的料液質(zhì)量濃度和料液體積，g/L，L。

1.2.7 阿拉伯低聚半乳糖對(duì)雙歧桿菌生長(zhǎng)速率的影響

1.2.7.1 雙歧桿菌活化

雙歧桿菌活化采用改良MRS培養(yǎng)基，121 ℃高壓滅菌15 min后備用。

在無(wú)菌無(wú)氧操作條件下，取雙歧桿菌菌種，接種于雙歧桿菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后，取5%的接種量在改良MRS中傳代3次，以10 000 r/min離心15 min后收集沉淀，重懸于無(wú)菌生理鹽水中后，將活性菌轉(zhuǎn)移到含有不同碳源的培養(yǎng)基中。

1.2.7.2 阿拉伯低聚半乳糖對(duì)雙歧桿菌活化生長(zhǎng)曲線的影響

在無(wú)菌無(wú)氧的情況下執(zhí)行以下操作：進(jìn)行在酶標(biāo)板上加入150 μL雙歧桿菌培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中分別加入阿拉伯半乳聚糖和降解后的阿拉伯低聚半乳糖，以10 μL硅油液封。置入熒光細(xì)胞分析儀中，靜置培養(yǎng)20 h，采用雙波長(zhǎng)法，每隔2 h測(cè)量1次600和800 nm處吸收波長(zhǎng)，以葡萄糖為對(duì)照組，研究阿拉伯低聚半乳糖對(duì)雙歧桿菌體外生長(zhǎng)曲線的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

所有試驗(yàn)做3個(gè)平行，取平均值，處理數(shù)據(jù)采用Origin Pro 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解液中Oligo-AG相對(duì)分子質(zhì)量分布

超濾膜包的選擇應(yīng)根據(jù)超濾組分相對(duì)分子質(zhì)量大小來(lái)確定，因此對(duì)降解后的阿拉伯半乳聚糖相對(duì)分子質(zhì)量分布采用HPSEC-MALLS法進(jìn)行測(cè)定，其分布情況如圖2所示。由圖2可見，Oligo-AG相對(duì)分子質(zhì)量較小，分布不集中，其跨度約500～5 000 Da，因此采用5 kDa的超濾膜組件對(duì)Oligo-AG進(jìn)行膜分離。

對(duì)該組件的多糖截留和透過(guò)效果進(jìn)行考察，截留液中Oligo-AG質(zhì)量濃度為3.18 g/L，透過(guò)液中Oligo-AG質(zhì)量濃度為7.59 g/L，損失率為3.41%，占總Oligo-AG的71.53%。結(jié)果表明，采用5 kDa超濾膜組件具有較好的分離純化效果，同時(shí)符合文獻(xiàn)報(bào)道的該部分組分活性較好的規(guī)律[18-19]。因此先采用5 kDa膜組件分離出相對(duì)分子質(zhì)量小于5 kDa的組分，再采用納濾膜組件對(duì)500 Da以下的葡萄糖、寡糖等小分子物質(zhì)進(jìn)行分離。

2.2 料液比對(duì)膜通量的影響

不同稀釋度的Oligo-AG降解液對(duì)5 kDa膜組件膜滲透通量的影響如圖3所示。從圖3可以看出，鑒于對(duì)降解液進(jìn)行稀釋有助于提高膜通量，因而隨著降解液濃度的降低，料液黏度降低，降解液在膜組件中的流動(dòng)性變小，進(jìn)而降低了滲透阻力和濃差極化[19]。雖然不斷降低Oligo-AG的濃度可使膜通量繼續(xù)增加，但同時(shí)Oligo-AG分離效率和多糖得率也會(huì)降低。因此，初步選擇稀釋濃度60%。

圖2 降解液中Oligo-AG的相對(duì)分子質(zhì)量分布

圖3 降解液濃度對(duì)膜通量的影響

2.3 操作壓力對(duì)膜通量的影響

操作壓力是超濾系統(tǒng)的主要作用力，對(duì)膜分離效果的作用至關(guān)重要。稀釋倍數(shù)1∶5時(shí)，不同操作壓力對(duì)超濾分離Oligo-AG的膜滲透通量的影響如圖4所示。同一壓力條件下，Oligo-AG料液的膜滲透通量隨著超濾時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。這是因?yàn)樵诔瑸V初始階段，膜表面形成凝膠層，而隨著時(shí)間增長(zhǎng)，料液逐漸阻塞腹孔，超濾膜滲透阻力升高，導(dǎo)致膜通量降低。相同時(shí)間下，隨著操作壓力升高，Oligo-AG的滲透通量逐漸升高。這主要是由于增大壓力即增大了膜分離的推動(dòng)力，然而壓力過(guò)高會(huì)使得溶質(zhì)的透過(guò)速率比溶劑小，這會(huì)導(dǎo)致透過(guò)液多糖濃度降低，截留率升高，使得Oligo-AG的總回收率降低。因而綜合考慮系統(tǒng)操作壓力要求和多糖損失率，壓力不宜過(guò)高，初步選取的操作壓力為0.2 MPa。

2.4 料液溫度對(duì)膜通量的影響

稀釋倍數(shù)1∶5，操作壓力0.2 MPa時(shí)，料液溫度對(duì)超濾分離Oligo-AG膜滲透通量的影響如圖5所示。同一時(shí)間下，膜通量隨著料液溫度的升高而增大。這是因?yàn)殡S著料液溫度升高，多糖降解液的黏度降低，有利于降解液中的Oligo-AG在溶液中擴(kuò)散，提高了降解液在膜組件中的流動(dòng)性，可以減少超濾膜表面污染物的吸附，進(jìn)而使得滲透阻力與濃差極化均不斷降低。然而料液溫度的升高的同時(shí)還需要考慮膜能耗和膜性能，以及保證該溫度范圍內(nèi)的多糖性質(zhì)不變。由于料液溫度超過(guò)20 ℃時(shí)，超濾膜的濃差極化時(shí)間推遲，膜通量變化不再明顯，且考慮到膜的耐受性，試驗(yàn)選取的溫度范圍為20 ℃。

圖4 操作壓力對(duì)膜通量的影響

圖5 料液溫度對(duì)膜通量的影響

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化

為使單位時(shí)間內(nèi)超濾膜多糖透過(guò)量最大，并且膜通量也較高，使得膜分離效率最大化。采用L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)3個(gè)主要參數(shù)，即降解液濃度、操作壓力、料液溫度進(jìn)一步優(yōu)化。試驗(yàn)因素和水平表見表1。

所得結(jié)果采用極差分析和方差分析，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表2。

極差分析可以通過(guò)各水平平均值極大值與極小值的差來(lái)表示出各因素對(duì)膜通量和多糖透過(guò)量的影響大小，極差值越大，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響越大。由表2可知，膜通量極差值最大的因素為稀釋倍數(shù)，其R=6.83，即稀釋倍數(shù)對(duì)膜通量影響最大，多糖透過(guò)量極差值最大的因素為操作壓力，其R=29.29，即操作壓力對(duì)多糖透過(guò)量影響最大。膜通量平均值最大的組合為A1B2C3，多糖透過(guò)量平均值最大的組合為A2B3C3，因此可以確定料液溫度為20 ℃時(shí)，分離效率最高。對(duì)各因素進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

根據(jù)方差分析（表3）結(jié)果可知，3個(gè)因素中稀釋倍數(shù)和操作壓力對(duì)膜通量和多糖透過(guò)量均具有顯著性影響（p＜0.05），料液溫度對(duì)膜通量和多糖透過(guò)量的影響均不顯著（p＞0.05），其中對(duì)膜通量的影響最顯著的是稀釋倍數(shù)，而對(duì)多糖透過(guò)量的影響最顯著的是操作壓力，這與正交試驗(yàn)結(jié)果相吻合。雖然操作壓力的升高對(duì)膜通量的升高具有正向作用，但對(duì)多糖透過(guò)量卻具有反向作用，因此，結(jié)合以上分析，能夠獲得最佳分離效率的膜分離條件應(yīng)取稀釋倍數(shù)1∶5，操作壓力0.2 MPa，料液溫度20 ℃為最佳操作參數(shù)，這與多糖的膜分離規(guī)律相符[21]。

表1 L9(33)正交試驗(yàn)因素和水平表

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

2.6 膜分離后的Oligo-AG的相對(duì)分子質(zhì)量分布

對(duì)經(jīng)過(guò)超濾膜組件及納濾膜組件分離純化后得到的Oligo-AG相對(duì)分子質(zhì)量分布進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。經(jīng)過(guò)膜分離的多糖，其主要成分為4 500 Da的Oligo-AG，純度約91.2%。在正交試驗(yàn)中獲得的最佳條件下，膜分離結(jié)果表明膜通量和多糖的透過(guò)量而分別為25.3 L/（m2·h）和130.32 g·m2/h，多糖損失率較低，僅2.34%。

圖6 分離純化后的Oligo-AG的相對(duì)分子質(zhì)量分布

2.7 膜分離后的Oligo-AG對(duì)雙歧桿菌生長(zhǎng)曲線的影響

經(jīng)過(guò)膜分離的Oligo-AG和AG對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌生長(zhǎng)速率的影響如圖7所示。前2 h雙歧桿菌在不同碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度緩慢，處于遲緩期，培養(yǎng)2 h后，雙歧桿菌進(jìn)入對(duì)數(shù)期，這期間活菌數(shù)和增值速率急劇增加，然而由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限，8 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期，并產(chǎn)生如乙酸、乳酸、丙酸等代謝物[22]。在同一時(shí)間內(nèi)，AG作為碳源的培養(yǎng)基中雙歧桿菌活菌數(shù)對(duì)數(shù)值比對(duì)照組高11.20%，而相對(duì)于AG，Oligo-AG所在的培養(yǎng)基內(nèi)雙歧桿菌活菌數(shù)的對(duì)數(shù)值比AG高14.34%，比葡萄糖高28.89%，可以明顯促進(jìn)雙歧桿菌繁殖。前2 h雙歧桿菌處于穩(wěn)定期，培養(yǎng)基的pH 2～8 h內(nèi)迅速降低，雙歧桿菌活菌數(shù)與pH呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明雙歧桿菌可利用葡萄糖、AG和Oligo-AG產(chǎn)生酸代謝物。由圖7可見，相對(duì)葡萄糖和AG而言，Oligo-AG作為碳源時(shí)，培養(yǎng)基的pH更低，即雙歧桿菌對(duì)Oligo-AG的利用率更高。以上結(jié)果表明，Oligo-AG更適合作為雙歧桿菌的碳源，能夠提高雙歧桿菌的生長(zhǎng)速率及活菌數(shù)。

圖7 膜分離純化后的Oligo-AG對(duì)雙歧桿菌生長(zhǎng)曲線的影響

3 結(jié)論

采用超聲輔助自由基的方法降解阿拉伯半乳聚糖，并選用5 kDa超濾膜和納濾膜對(duì)其進(jìn)行分離純化。研究降解液濃度、操作壓力、料液溫度分別對(duì)Bio-5超濾膜分離效果的影響，通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化3個(gè)操作參數(shù)，結(jié)果得出超濾條件為稀釋倍數(shù)1∶5、操作壓力0.2 MPa、料液溫度20 ℃時(shí)，具有最佳的分離效果。在此條件下，膜通量和多糖透過(guò)量分別達(dá)到25.3 L/（m2·h）和130.32 g·m2/h，所得Oligo-AG組分的純度為91.2%，透過(guò)率占降解液總多糖的31.24%，損失率為3.11%。且相較于未降解的阿拉伯半乳聚糖，經(jīng)過(guò)降解和膜分離純化的Oligo-AG對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌的生長(zhǎng)數(shù)量具有明顯的促進(jìn)作用。與傳統(tǒng)分離純化方法相比，膜分離法可以更加快速高效的完成低聚多糖的分離純化，有利于更好地實(shí)現(xiàn)低聚多糖的功能性研究。