李麗，袁建琴，唐中偉，王文斌

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（晉中 030801）

山楂（Crataegus pinnatifidaBunge）是薔薇科植物屬落葉喬木，可消食，可促進(jìn)胃分泌較多的胃消化酶；其提取物能降低血液黏度、提高心肌的供氧和供血能力，增強(qiáng)心臟功能、降低血壓、抗心律失常等[1-8]。多糖一般是由成百上千，通過糖苷鍵連接的單糖形成的，具有較多的生物活性。有關(guān)研究表明，一些活性多糖具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗腫瘤及調(diào)血脂等作用[9]。唐禮可[10]的研究表明山楂中的多糖可以提高動物機(jī)體的耐缺氧能力且能提高運(yùn)動負(fù)荷的適應(yīng)能力。

目前，多糖的提取方法有微波法、離子交換法、超聲輔助法等[11]，閃式提取法利用機(jī)械剪切刀對藥物進(jìn)行切割，并進(jìn)行攪拌，隨著提取物顆粒的逐漸變小，提取液與藥材顆粒間的化學(xué)組分在破碎的過程中分布并且在平衡和不平衡之間快速來回轉(zhuǎn)換，最終徹底破碎，達(dá)到完全平衡[12-14]。同時(shí)，利用超速動態(tài)分子的滲透作用，使已經(jīng)剪碎的物質(zhì)與溶劑分子作用，最終從藥材中分離出來，進(jìn)入到提取液中，從而實(shí)現(xiàn)提取活性成分的目的。閃提技術(shù)具有操作簡單，用時(shí)少，提取液的用量少，使用起來安全可靠等優(yōu)點(diǎn)。

通過3個(gè)不同的單因素試驗(yàn)，研究其對多糖提取率的影響，并在響應(yīng)面的分析軟件中確定出其最優(yōu)組合，以得到多糖的最高提取率。該試驗(yàn)為山楂資源的工業(yè)化和產(chǎn)業(yè)化提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂鮮果實(shí)（市售）；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、無水乙醇、6%苯酚溶液、濃硫酸；試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)器材

JHBE-50T中草藥閃式提取器（河南智晶生物科技）；SBZ-019中草藥粉碎機(jī)（天津泰斯特）；數(shù)顯股份干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)）；標(biāo)準(zhǔn)篩（淄博史克制藥設(shè)備制造）；7200-型分光光度計(jì)（尤尼柯儀器）；抽濾真空泵（鄭州市亞榮儀器）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 材料的處理

將新鮮山楂洗凈，去掉核，果肉置于60 ℃烘箱中烘至恒重并用粉碎機(jī)粉碎，過篩（孔徑0.18 mm），將粉末放入潔凈干燥的玻璃瓶中，并將其密封，備用。

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立[15-16]

取1 g干燥至恒重的葡萄糖粉末，定容到1 000 mL的容量瓶中，顛倒搖勻，配制得到1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。從中量取0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mL的溶液于5支干燥潔凈的試管中，并全部補(bǔ)水至1 mL，得到質(zhì)量濃度為0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別依次加入1 mL 6%的苯酚溶液和5 mL的濃硫酸，振蕩，沸水浴15 min，迅速冷卻至室溫，以實(shí)驗(yàn)室使用的蒸餾水作對照，置于540 nm下的分光光度計(jì)中測吸光度。

1.3.3 多糖的測定方法[17]

吸取0.2 mL已制備好的多糖溶液于干燥潔凈的試管中，加入0.8 mL的蒸餾水，采用和標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的制作方法測定樣品吸光度A，按式（1）計(jì)算相應(yīng)濃度C。

式中：C為稀釋后溶液的質(zhì)量濃度，mg/mL；m為稱量的山楂粉質(zhì)量，mg。

1.3.4 液料比[15-16]

稱取4份1 g的干燥山楂粉，放入4個(gè)藍(lán)蓋瓶中，按液料比30∶1，40∶1，50∶1和60∶1（mL/g）加入蒸餾水，用保鮮膜和橡皮筋封住瓶口，搖勻，在提取電壓為100 V、提取時(shí)間為90 s的條件下進(jìn)行閃式提取，將閃提后的物質(zhì)置于干燥的大離心杯中，按5 000 r/min離心15 min，取出其上清液進(jìn)行抽濾，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至3 mL，轉(zhuǎn)移至15 mL的離心管中，加入4倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀，放入4 ℃冰箱，12 h后取出離心管，將管中物質(zhì)進(jìn)行抽濾，置于60 ℃烘箱中將抽濾后得到的多糖進(jìn)行干燥，取出后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度線，搖勻。后續(xù)步驟同1.3.3中多糖的方法進(jìn)行測定，并重復(fù)3次試驗(yàn)，取其平均值。

1.3.5 提取電壓

稱取4份1 g的干燥山楂粉，放入4個(gè)藍(lán)蓋瓶中，按液料比40∶1（mL/g）加入蒸餾水，用保鮮膜封住瓶口，搖勻，在提取時(shí)間為90 s、電壓分別為90，100，110和120 V的條件下進(jìn)行閃式提取，后續(xù)步驟同1.3.4。

1.3.6 提取時(shí)間

稱取4份1 g的干燥山楂粉，放入4個(gè)藍(lán)蓋瓶中，按液料比40∶1（mL/g）加入蒸餾水，用保鮮膜封住瓶口，搖勻，在提取電壓為110 V，提取時(shí)間分別為80，90，100和110 s的條件下進(jìn)行閃式提取。后續(xù)步驟同1.3.4。

1.3.7 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)

為了得到最優(yōu)的因素組合，在Design-Expert 8.0.6分析軟件中設(shè)定液料比（A）、提取電壓（B）和提取時(shí)間（C）這3個(gè)因素的水平[18]。如表1所示。

表1 響應(yīng)面分析的因素和水平

2 分析與結(jié)果

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

如圖1所示，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=1.366X-0.027 1，R2=0.991 6，表明線性關(guān)系良好。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 液料比對山楂果肉中多糖提取率的影響

由圖2可知，隨著液料比的增加，溶液濃度減小，山楂果肉中提取到的多糖顯著增加，當(dāng)液料比為40∶1（mL/g）時(shí)，果肉中的多糖得率達(dá)到最大值，但隨著液料比例的繼續(xù)增加，多糖得率有所減少。由此確定，液料比40∶1（mL/g）是提取多糖的最優(yōu)條件。

圖2 液料比對得率的影響圖

2.2.2 提取電壓對山楂果肉中多糖提取率的影響

由圖3可知，在100～110 V電壓下，多糖得率有所上升；在110 V時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值；超過110 V后，得率顯著減少。由此確定，提取電壓110 V是多糖提取的最佳電壓。

2.2.3 提取時(shí)間對山楂果肉中多糖提取率的影響

由圖4可知，隨著時(shí)間延長，多糖得率增多；當(dāng)時(shí)間為90 s時(shí)，多糖得率最多；再隨著時(shí)間的增加，得率下降。由此確定，時(shí)間90 s是提取山楂多糖的最佳時(shí)間。

圖3 提取電壓對得率的影響圖

圖4 提取時(shí)間對得率的影響圖

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

用響應(yīng)面分析軟件，建立15種組合，并通過試驗(yàn)得到不同組合下的多糖得率，結(jié)果見表2。對回歸模型的方差分析，結(jié)果見表3。

由表3中的p值可知，此方程模型是顯著的，失擬項(xiàng)比F值不顯著，方程的F=34.30，p＜0.05，表明二次方程擬合極顯著；A、B、C、BC、A2、B2、C2的p值均小于0.05，呈顯著水平，而AB、AC的p＞0.05，是不顯著的。所以在這個(gè)試驗(yàn)中，各種因素對山楂果肉多糖提取率的影響由大到小依次為提取電壓＞提取時(shí)間＞液料比。

表3 回歸模型方差分析

2.3.2 響應(yīng)面分析結(jié)果

由圖5～圖7可知，3種因素間的互作用對多糖的提取均有影響，每個(gè)因素均有雙向增加的現(xiàn)象。

圖5 液料比和提取電壓的交互圖

圖6 液料比和提取時(shí)間的交互圖

圖7 提取電壓和提取時(shí)間的交互圖

由圖7的3D可知，提取電壓-提取時(shí)間交互作用的傾斜度最大，曲線較陡，因此山楂果肉中多糖的提取率受提取電壓-提取時(shí)間的影響最大；由圖6的3D圖可知，液料比-提取時(shí)間交互作用的傾斜率較小，曲線較緩，所以多糖得率受液料比-提取時(shí)間的影響次之；由圖5的3D可知，液料比-提取電壓的傾斜度最小，曲線較平滑，所以多糖得率受液料比-提取電壓的交互作用影響最小。

3 結(jié)論與討論

選擇合適的液料比、電壓和提取時(shí)間可以獲得較高的山楂多糖的提取率，根據(jù)響應(yīng)面分析法建立的各種單因素的最優(yōu)試驗(yàn)條件是：液料比42∶1（mL/g），提取電壓105 V，提取時(shí)間86 s。在此理論下測得多糖的得率為6.63%，而軟件預(yù)測值為6.67%，對比相差0.04%。由此可見，試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦x擇合理，具有實(shí)用價(jià)值。

閃式提取中在以液料比為單因素的試驗(yàn)中，液料比在達(dá)到40∶1（mL/g）后，再隨著液體的增多，得率減少，其原因可能是提取時(shí)的液體較多，濃度相對減小，導(dǎo)致刀片與山楂的剪切率下降，使山楂中多糖的有效成分提取不完全；也可能是其他物質(zhì)的溶出而抑制了多糖的提取[19]；在以提取電壓為單因素的試驗(yàn)中，當(dāng)電壓為110 V時(shí)，得率達(dá)到最大值，之后電壓增大，提取率減少，其原因可能是在高速電機(jī)的帶動下，內(nèi)外刀在高速旋轉(zhuǎn)的過程中影響了某一部分多糖的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致得率減少；在以提取時(shí)間為單因素的試驗(yàn)中，當(dāng)時(shí)間達(dá)到90 s時(shí)，得率最高，隨著時(shí)間的延長，其得率降低，其原因可能是在提取的過程中刀頭不斷剪切，本就可以產(chǎn)生較多熱量，繼而隨著提取時(shí)間的延長，溶液溫度升高很快，不穩(wěn)定的化學(xué)成分易發(fā)生變化[20-21]。

由此次試驗(yàn)可知，閃式提取可得到山楂果肉中的多糖，且閃式提取與超聲輔助法提取技術(shù)相比，閃提法得率為6.63%，而超聲輔助法得率為1.85%[22]；閃式提取法與微波法相比，微波法的提取率為1.53%，得率比閃提法的得率低，且盡管微波法的時(shí)間相對其他方法時(shí)間相對要短，但閃式提取只需要90 s，時(shí)間比微波法3 min的時(shí)間更短[15]。相比之下，閃式提取法速度快，省時(shí)，能大大提高提取率，是一種高效提取山楂多糖的方法。