李赟，王超

1. 浙江農(nóng)林大學農(nóng)業(yè)與食品科學學院（杭州 311300）；2. 浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術研究重點實驗室（杭州 311300）

菌核側(cè)耳（Pleurotus tuber-regium（Fr.）Sing）是一類珍稀的食藥兩用真菌。菌核側(cè)耳的菌絲、子實體和菌核中均含有豐富的蛋白質(zhì)、礦質(zhì)元素、多種維生素、真菌多糖、甾體、膳食纖維等活性成分[1-2]。現(xiàn)代醫(yī)藥學研究發(fā)現(xiàn)，多糖為菌核側(cè)耳的重要活性物質(zhì)之一，具有降血脂、降血壓、提高人體免疫力、止咳化痰和抗腫瘤等功效[3-5]。

自然界野生菌核側(cè)耳的子實體與菌產(chǎn)量較小，遠遠低于人們的需求。固態(tài)培養(yǎng)更接近于菌核側(cè)耳在自然界野生狀態(tài)下的生理習性，有利于菌絲的生長及活性物質(zhì)的表達[6]。此次試驗以農(nóng)林廢棄物竹粉和桑葉作為固體培養(yǎng)基主料，探索菌核側(cè)耳在此培養(yǎng)基上生長及高產(chǎn)菌絲多糖的適宜條件，并對菌絲多糖的性質(zhì)進行初步分析，為菌核側(cè)耳人工培育及其精深加工，為竹產(chǎn)業(yè)的循環(huán)發(fā)展，提供重要的基礎數(shù)據(jù)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌核側(cè)耳，購自中國普通微生物菌種保藏中心，4 ℃保存于PDA斜面培養(yǎng)基上；竹粉，取自浙江臨安板橋竹材加工廠，分攤曬干后，除去竹蔑等雜物，包裝備用；桑葉，采摘自浙江農(nóng)林大學東湖校區(qū)林場，去除病殘葉片，清洗，在50 ℃烘箱中烘干2 h，剪碎備用。

果糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、半乳糖等試劑均為分析純。

斜面培養(yǎng)基：土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，pH自然。

液態(tài)種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母膏5 g/L，KH2PO41 g/L，VB10.01 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，pH自然。

固態(tài)基礎培養(yǎng)基：竹粉60 g，按KH2PO41 g/L、VB10.01 g/L的濃度溶解于水中，固態(tài)基質(zhì)的初始含水率60%，pH自然。

1.2 儀器與設備

立式壓力蒸汽滅菌器（江陰濱江醫(yī)療設備有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA（上海亞榮生化儀器廠）；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（上海金平）；低溫冷凍離心機（艾本德中國有限公司）；UV-5500紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）。傅里葉變換紅外光譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；高效液相凝膠色譜儀（美國懷雅特技術公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 液態(tài)種子培養(yǎng)

挑選長勢良好的斜面菌種轉(zhuǎn)接到殺菌冷卻后裝有150 mL液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，在25 ℃，120 r/min條件下恒溫培養(yǎng)4 d，用無菌紗布過濾后得菌懸液，備用。

1.3.2 單因素研究

1.3.2.1 固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)配比的研究

固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)選擇竹粉和桑葉，以菌絲生長態(tài)勢和菌絲多糖含量為指標，考察竹粉和桑葉最適宜的質(zhì)量比。試驗共分5組，每組中竹粉和桑葉的總質(zhì)量均為60 g。Ⅰ組，竹粉60 g、桑葉0 g；Ⅱ組，竹粉40 g、桑葉20 g；Ⅲ組，竹粉30 g、桑葉30 g；Ⅳ組，竹粉20 g、桑葉40 g；Ⅴ組，竹粉0 g、桑葉60 g。

在500 mL三角瓶中分別裝入固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)（按上述比例，共60 g），不另外添加碳源、氮源、無機鹽，主要考察固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)直接培養(yǎng)菌核側(cè)耳菌株的效果。用牛皮紙裹四層紗布封口，于121 ℃滅菌40 min，冷卻至室溫后，每瓶基質(zhì)中接入10 mL活化后的菌懸液，培養(yǎng)基初始含水率60%，于28 ℃恒溫培養(yǎng)20 d，取出帶有菌絲的固態(tài)基質(zhì)，進行分析測定[7-8]。

1.3.2.2 外加碳源的研究

根據(jù)1.3.2.1的研究結(jié)果，改變培養(yǎng)基中的碳源，研究碳源對菌絲多糖含量的影響[8]。分別按照基質(zhì)干質(zhì)量（60 g）的2%，即1.2 g果糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、半乳糖溶解到90 g純凈水中，以菌絲多糖含量為指標，考察最適宜的外加碳源種類。

1.3.2.3 外加氮源的研究

根據(jù)1.3.2.1的研究結(jié)果，改變培養(yǎng)基中的氮源[9]，研究氮源對菌絲多糖含量的影響。將牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、玉米粉、黃豆粉單一氮源，分別按照基質(zhì)干質(zhì)量的0.5%，即0.3 g添加到60 g固態(tài)基質(zhì)中，調(diào)整培養(yǎng)基初始含水率為60%，以菌絲多糖含量為指標，考察最適宜的外加氮源種類。

1.3.2.4 外加無機鹽的研究

根據(jù)1.3.2.1的研究結(jié)果，改變培養(yǎng)基中的無機鹽[10]，將KCl、MgSO4、ZnSO4、FeCl2和CaCl2分別按照基質(zhì)干質(zhì)量的0.05%，即0.03 g分別溶解到90 g純凈水中，以菌絲多糖含量為指標，考察最適宜的外加無機鹽種類。

1.3.3 正交試驗研究

以菌核側(cè)耳菌絲多糖含量為指標，采用正交試驗，考察固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)（竹粉和桑葉的配比）、外加碳源、外加氮源和外加無機鹽4個因素的交互作用，因素水平設計見表1。

表1 正交試驗的因素水平設計（L9(34)）

1.3.4 菌絲生物量的測定

將發(fā)酵20 d后的固體菌絲從固體培養(yǎng)基中分離，過篩除去基質(zhì)粉末，于60 ℃恒溫干燥72 h，用粉碎機粉碎后稱重[11]。

1.3.5 菌絲多糖的提取

取10 g干燥的菌絲體，按照每克菌絲體加20 mL純凈水的比例，加入200 mL的純凈水，在90 ℃下水浴提取2 h，將浸提液以8 000 r/min離心20 min，保存上清液。取離心后的殘渣，按照每克殘渣加20 mL純凈水的比例加入純凈水，在90 ℃下水浴提取2 h，浸提液以8 000 r/min離心20 min，取上清液。將2次上清液合并，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至50.0 mL左右，再將濃縮液和95%的乙醇按1∶4（V/V）的比例混合，醇沉過夜，以4 000 r/min離心20 min，將沉淀物依次用無水乙醇、丙酮潤洗3～4次，干燥，獲取菌核側(cè)耳菌絲多糖[12-13]。

1.3.6 菌絲多糖含量的測定

先按苯酚硫酸法繪制標準曲線[14]；再稱取1菌絲多糖，用50 mL蒸餾水溶解，吸取2 mL，加入1 mL體積分數(shù)為5%的苯酚溶液，再加入5 mL濃硫酸，迅速振蕩均勻。室溫下靜置10 min，在490 nm處測定吸光度，計算菌絲多糖含量。

1.3.7 傅里葉紅外檢測菌絲多糖

將菌絲多糖置于40 ℃烘箱中干燥，稱取2 mg加入200 mg的溴化鉀進行壓片，然后進行紅外光譜測定，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.8 GPC測菌絲多糖的相對分子質(zhì)量

稱取20 mg菌核側(cè)耳菌絲多糖，溶于超純水中，上機檢測。色譜條件：色譜柱，Shodex OHpak系列SB-806串803；流速，1 mL/min；流動相，水和0.02%疊氮化鈉；柱溫，40 ℃；進樣量，500 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗重復3次，數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0分析，采用Origin 2017軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素研究結(jié)果

2.1.1 固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)配比對菌核側(cè)耳生長的影響

從表2可以看出，當竹粉與桑葉質(zhì)量比為2∶1時，菌絲生長狀態(tài)最好：菌絲潔白致密，纏繞盤結(jié)于料層內(nèi)部，有利于后期形成菌核；而單一使用竹粉和桑葉時，菌絲發(fā)滿培養(yǎng)料層的時間偏長，菌絲略黃，菌絲不夠致密，這可能是單一的基質(zhì)不能供給足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，當竹粉與桑葉質(zhì)量比為2∶1時，其內(nèi)部的碳、氮等物質(zhì)有利于菌絲的生長。

表2 基質(zhì)種類對菌核側(cè)耳菌絲萌發(fā)及生長的影響

從圖1可以看出，當竹粉與桑葉質(zhì)量比為2∶1配比時，菌絲多糖含量最高，這表明良好的菌絲生長為多糖等活性物質(zhì)的分泌表達奠定了良好的生物學基礎。因此，在后續(xù)單因素試驗中，固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)中竹粉與桑葉的質(zhì)量比為2∶1。

圖1 固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)對菌核側(cè)耳產(chǎn)菌絲多糖的影響

2.1.2 外加碳源對菌核側(cè)耳產(chǎn)菌絲多糖的影響

從圖2可以看出，碳源對菌核側(cè)耳產(chǎn)菌絲多糖有不同的影響，果糖和葡萄糖均有較好的促進作用，甘露糖次之，半乳糖最差。從經(jīng)濟角度考慮，選定葡萄糖為最優(yōu)碳源。

圖2 外加碳源對菌核側(cè)耳產(chǎn)菌絲多糖的影響

2.1.3 外加氮源對菌核側(cè)耳產(chǎn)菌絲多糖的影響

從圖3可以看出，外加無機氮源和有機氮源對菌核側(cè)耳產(chǎn)菌絲多糖均有一定的促進作用。其中，酵母粉促進效果最好，菌絲多糖含量為7.6 mg/g，蛋白胨和牛肉膏促進效果相似，菌質(zhì)多糖含量均為7.1 mg/g，使用黃豆粉和玉米粉后的結(jié)果分別為6.8和6.7 mg/g。分析其原因：固態(tài)培養(yǎng)過程中，菌絲匍匐伸展，因此基質(zhì)的疏松狀態(tài)對菌絲生長至關重要。添加酵母粉的發(fā)酵基質(zhì)相對疏松，黏結(jié)程度不高，有利于菌絲獲取營養(yǎng)成分和生長。

2.1.4 添加無機鹽對菌核側(cè)耳產(chǎn)菌質(zhì)多糖的影響

從圖4可以看出，金屬離子對菌核側(cè)耳產(chǎn)菌絲多糖有一定的促進或抑制作用。K+、Mg2+、Zn2+有促進作用，其中Zn2+最好，因此選擇Zn2+作為外加金屬離子。

圖3 外加氮源對菌核側(cè)耳產(chǎn)菌絲多糖的影響

圖4 添加無機鹽對菌核側(cè)耳產(chǎn)菌絲多糖的影響

2.2 正交試驗研究結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對竹粉和桑葉質(zhì)量比、外加碳源、外加氮源、無機鹽進行四因素三水平（L9(34)）正交試驗，結(jié)果見表3。

極差分析表明，影響菌核側(cè)耳產(chǎn)菌絲多糖的主次因素為D＞A＞C＞B，最優(yōu)組合為A3B1C1D2，即竹粉與桑葉質(zhì)量比2∶1、葡萄糖用量1%、酵母粉用量0.25%、Zn2+用量0.05%。

表3 正交試驗結(jié)果

2.3 菌核側(cè)耳產(chǎn)菌絲多糖的驗證試驗結(jié)果

因最優(yōu)組合A3B1C1D2并不在正交試驗表中，按照A3B1C1D2，在菌懸液接種量10%，培養(yǎng)基初始含水率60%條件下28 ℃恒溫培養(yǎng)20 d，結(jié)果如圖5所示。

從圖5可以看出，菌核側(cè)耳在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)前10 d生長緩慢，在菌絲發(fā)滿料層的底層后，生長迅速，在第16天發(fā)滿整個培養(yǎng)料層；菌絲多糖的含量也隨著菌絲的粗壯、纏繞盤結(jié)而增多，在第18和第19天時達到最高，每瓶培養(yǎng)料中菌絲生物量（干質(zhì)量）可達155 mg，菌絲多糖含量達13.8 mg/g。

圖5 菌核側(cè)耳產(chǎn)菌絲多糖驗證試驗結(jié)果

2.4 菌核側(cè)耳菌絲多糖的紅外光譜分析

從圖6可以看出，波數(shù)3 424.73 cm-1處的吸收峰強而且寬，是O—H的伸縮振動[15]；波數(shù)2 928.13 cm-1為CH2或CH上的C—H的伸縮振動；波數(shù)1 653.07 cm-1處為糖醛酸中羰基C＝O鍵非對稱的伸縮振動峰[16]；波數(shù)1 401.63 cm-1為C—H彎曲振動吸收峰；波數(shù)1 200～1 000 cm-1吸收峰是由糖環(huán)上或糖苷鍵上C—O—C伸縮振動所引起的[17]；波數(shù)973.22 cm-1為吡喃環(huán)的吸收峰[18]。

圖6 菌絲多糖紅外光譜

2.5 菌核側(cè)耳多糖的分子摩爾質(zhì)量

從圖7可以看出，光散射和示差檢測器所產(chǎn)生的峰的大小和形狀幾乎重合，這表明2種檢測器間的延遲已被準確地確定。菌核側(cè)耳菌絲多糖的出峰時間為12.13～35.83 min，菌核側(cè)耳菌絲多糖的重均分子摩爾質(zhì)量MW為4.751×104g/mol，數(shù)均分子摩爾質(zhì)量Mn為2.880×104g/mol，最高峰分子摩爾質(zhì)量（峰尖分子摩爾質(zhì)量）Mp為3.488×104g/mol，Z均分子摩爾質(zhì)量MZ為1.126×106g/mol，MW/Mn的值為1.649，表明菌核側(cè)耳的菌絲多糖是一類中等分布聚合物。

圖7 菌絲多糖分子摩爾質(zhì)量譜圖

如圖8所示，在重均分子摩爾質(zhì)量分析的基礎上，采用ASTRA軟件對4個分子摩爾質(zhì)量劃分區(qū)間的菌核側(cè)耳菌絲多糖的分子摩爾質(zhì)量進行統(tǒng)計分析，4個分子摩爾質(zhì)量劃分的區(qū)間分別為：200～2.6×104，2.6×104～7.5×104，7.5×104～2.6×105和2.6×105～9.6×105g/mol。菌核側(cè)耳菌絲多糖分子摩爾質(zhì)量分布情況如表4所示，菌絲多糖大部分分布在2.6×104～7.5×104g/mol之間，占其總分子數(shù)量的84.8%。

圖8 菌絲多糖分子摩爾質(zhì)量分布圖

表4 菌絲多糖分子摩爾質(zhì)量分布表

3 結(jié)論

1) 對菌核側(cè)耳固態(tài)培養(yǎng)的條件進行了分析和優(yōu)化，獲得了最佳培養(yǎng)條件，即竹粉與桑葉質(zhì)量比2∶1、葡萄糖用量1%、酵母粉用量0.25%、Zn2+用量0.05%，菌懸液接種量10%，培養(yǎng)基初始含水率60%，28 ℃恒溫培養(yǎng)20 d，每瓶培養(yǎng)料中菌絲生物量（干質(zhì)量）可達155 mg，菌絲多糖含量達13.8 mg/g，這為人工培育菌核側(cè)耳產(chǎn)菌絲多糖提供了重要的參考依據(jù)。

2) 對菌核側(cè)耳菌絲多糖進行了初步分析，結(jié)果表明，該多糖屬于一種吡喃糖，重均分子摩爾質(zhì)量MW為4.751×104g/mol，是一種中等分布聚合物，大部分分布在2.6×104～7.5×104g/mol之間，占其總分子摩爾質(zhì)量的84.8%。這為后續(xù)深入研究菌核側(cè)耳菌絲多糖的結(jié)構(gòu)、功能及生物活性奠定了一定的工作基礎。