張潤鋒，焦明靜,2，柯年峰,3

(1.湖北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 國家級生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，湖北 黃石 435002；2.思源實(shí)驗(yàn)學(xué)校，湖北 丹江口 442700；3.竹溪縣第一中學(xué)，湖北 十堰 442300)

全世界已發(fā)現(xiàn)27個(gè)鱘魚物種[1]，大多數(shù)物種被世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄列為瀕?；驑O危物種(IUCN, 版本2019.3查詢2020.3.16)。歷史上有幾個(gè)鱘魚物種，如達(dá)氏鱘(Acipenserdabryanus)、中華鱘(Acipensersinensis)和白鱘(Psephurusgladius)，曾廣泛棲息于長江中上游及其大多數(shù)支流[2]。在20世紀(jì)80年代以前，這些物種是長江上游漁業(yè)捕撈的重要對象[3]。然而，由于水壩建設(shè)、棲息地環(huán)境惡化和過度捕撈等原因，在過去幾十年里這些物種的自然群體急劇下降[4，5]。20世紀(jì)80年代，為了挽救長江中的鱘魚物種，這些物種被列為國家一級保護(hù)動(dòng)物，并開始禁止在長江中捕撈鱘魚[6]。同時(shí)，相繼啟動(dòng)了最大的國家保護(hù)計(jì)劃，并從2000年開始長江上游實(shí)行禁漁期制度[7]。一些鱘魚物種在孵化場實(shí)現(xiàn)了人工孵化，并將人工孵化幼魚放流長江以恢復(fù)種群。

位于長江三峽庫區(qū)的宜昌被譽(yù)為中華鱘的故鄉(xiāng)，是中國鱘魚人工繁育最大基地之一。自然群體和養(yǎng)殖群體的多樣性為鱘魚適應(yīng)變化的環(huán)境提供了必須的基因型范圍。雜合度豐富的群體中個(gè)體在生長、生殖和疾病抗性方面優(yōu)于雜合度低的群體[8]。鱘魚群體遺傳學(xué)研究可以為鱘魚物種的管理、可持續(xù)發(fā)展和保護(hù)提供有用信息[9，10]。微衛(wèi)星已經(jīng)應(yīng)用于鱘魚種群結(jié)構(gòu)、親魚鑒別等方面，以保護(hù)鱘魚多樣性和維持人工繁育近交最小化。本研究利用微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記分析長江三峽庫區(qū)三個(gè)人工養(yǎng)殖鱘魚物種歐洲鰉(Husohuso)、達(dá)氏鱘(Husodauricus)和雜交鱘(Acipenserschrencki♂×Husodauricus♀)的遺傳多態(tài)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

研究樣本采自湖北天峽鱘業(yè)有限公司(宜都市紅花套鎮(zhèn)，宜昌)。隨機(jī)采集147只7齡以上的鱘魚魚鰭組織，包括83只歐洲鰉、38只達(dá)氏鱘和26只雜交鱘。

1.2 PCR分析

按照試劑盒使用指南，利用QIAGEN DNA Mini Kit(Qiagen, 美國)從魚鰭組織提取基因組DNA.1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的質(zhì)量。利用8個(gè)微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記[11，12]對三個(gè)人工養(yǎng)殖鱘魚群體進(jìn)行多態(tài)性分析。微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記引物由北京奧科鼎威生物科技有限公司合成。

PCR反應(yīng)在96孔Bio-Rad MyCycler(Bio-Rad，美國)進(jìn)行。采用混合加樣法，即根據(jù)每一個(gè)反應(yīng)體系所需的各組分量和PCR反應(yīng)的個(gè)數(shù)，將各反應(yīng)組分所需總量計(jì)算出來，加入1.5 mL的EP管中，輕微震蕩充分混勻后瞬時(shí)離心，再分裝到每個(gè)加有模板DNA的PCR管中，瞬時(shí)離心，冷啟動(dòng)擴(kuò)增。最終，15 μl的PCR反應(yīng)體系包括0.4 U的Taq DNA聚合酶(Tiangen, 北京)、上下游引物各0.4 mM、四種dNPT各0.25 mM、2.0 mM MgCl2和1 ×Taq反應(yīng)緩沖液。擴(kuò)增反應(yīng)包括95 ℃預(yù)變性2 min，30個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸45 s)，72 ℃延伸10 min.微衛(wèi)星標(biāo)記引物序列、退火溫度見表1.

表1 本研究應(yīng)用的微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記的引物信息

1.3 微衛(wèi)星分析

取每個(gè)個(gè)體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物7μL和pBR322/MspIladder(Promega, 美國)4μL，加至8%的聚丙烯酰胺凝膠(29∶1 acrylamide∶bis acrylamide, 1 × TBE buffer)，先300V高壓電泳15min，然后200V電泳2h左右。

電泳結(jié)束后，將凝膠轉(zhuǎn)移到盛有蒸餾水的托盤中，用蒸餾水沖洗2次。加入10%乙醇固定10 min，棄去固定液。加入0.1% AgNO3溶液，放在脫色搖床上輕微搖晃15～30 min后，將硝酸銀溶液倒掉，用蒸餾水沖洗2次，每次15 s.加入2% Na2CO3溶液(用前加2mL甲醛，混勻)顯色，待條帶清晰后將溶液倒掉，然后加入4%乙酸溶液停止顯色。對凝膠拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)DNA條帶大小通過與pBR322/MspIladder(Promega, 美國)比較估計(jì)片段大小。根據(jù)每個(gè)個(gè)體片段大小和有無來統(tǒng)計(jì)每個(gè)群體在各微衛(wèi)星位點(diǎn)上的基因頻率和基因型頻率。利用在線軟件iMEC(https://irscope.shinyapps.io/iMEC/)計(jì)算期望雜合度(expected heterozygosity,He)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles,Ne)和多態(tài)信息含量(polymorphic information content，PIC)。因?yàn)轺\魚微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記的多倍體特性，Hardy-Weinberg平衡無法計(jì)算[13]，故本研究未計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

本研究應(yīng)用8個(gè)微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記評估三峽庫區(qū)天峽鱘業(yè)有限公司人工養(yǎng)殖的歐洲鰉(H.huso)、達(dá)氏鱘(H.dauricus)和雜交鱘(A.schrencki♂×H.dauricus♀)三個(gè)群體的遺傳多態(tài)性(表2)。微衛(wèi)星是一類在基因組中隨機(jī)分布的短的(2-5堿基對)串聯(lián)重復(fù)序列，呈現(xiàn)孟德爾共顯性遺傳。與傳統(tǒng)的遺傳標(biāo)記等位酶相比，微衛(wèi)星標(biāo)記易于區(qū)分，遺傳多態(tài)性豐富，可應(yīng)用PCR技術(shù)和非致死組織(魚鰭、血液、糞便、羽毛等)進(jìn)行分析。對于瀕危動(dòng)物的遺傳分析而言，利用非致死組織則顯得尤為重要。因此，微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記已經(jīng)成為鱘魚種群結(jié)構(gòu)和近交程度評估的有效工具[14～16]。本研究所應(yīng)用的8個(gè)微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記中，3個(gè)微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記Spl-101、Spl-117和Spl-173在3個(gè)人工養(yǎng)殖群體中擴(kuò)增到彌散的PCR產(chǎn)物，而其余5個(gè)微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記得到高度多態(tài)的PCR產(chǎn)物。

在本研究中，歐洲鰉、達(dá)氏鱘和雜交鱘3個(gè)人工養(yǎng)殖群體的5個(gè)多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記分別共得到42、38和29個(gè)等位基因，平均等位基因分別為8.4、7.6和5.8.總體而言，三個(gè)研究鱘魚群體的多態(tài)性指標(biāo)均較高(表2)。三個(gè)鱘魚群體歐洲鰉、達(dá)氏鱘和雜交鱘的平均期望雜合度分別為0.8280、0.8482和0.7563.三個(gè)鱘魚群體平均多態(tài)信息含量從低到高依次為雜交鱘0.7099、歐洲鰉0.8056和達(dá)氏鱘0.8288.遺傳研究表明，遺傳多態(tài)指標(biāo)PIC接近0.5的群體被認(rèn)為在遺傳上中度分化[17，18]，PIC大于0.6代表著群體具有高度多樣性[19，20]。在本研究中，三個(gè)鱘魚群體的平均PIC均高于0.6，所以可以推定三個(gè)群體具有豐富的遺傳多態(tài)性。三個(gè)研究群體之所以具有高度多態(tài)性，部分歸因于歐洲鰉、達(dá)氏鱘和雜交鱘的染色體的多倍性特征。同時(shí)，三峽庫區(qū)“公司+漁民”的漁業(yè)養(yǎng)殖模式可能是遺傳多樣性的另一個(gè)來源。這種漁業(yè)養(yǎng)殖模式鼓勵(lì)漁民將養(yǎng)殖5年左右的鱘魚出售給公司進(jìn)行繁育與魚子醬加工。因此，不同來源的鱘魚形成新的群體，提高了群體的遺傳多樣性。本研究使用的魚鰭組織即隨機(jī)采集自這些新的群體，這些都極大提高了本研究觀察到的3個(gè)人工養(yǎng)殖鱘魚群體的遺傳多態(tài)性。

表2 三個(gè)人工養(yǎng)殖鱘魚群體的遺傳多態(tài)性指數(shù)