孫長花，丁娟芳，王君，李曉鳳

(1.揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué) 生物與化工工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009)

隨著人們食品安全意識的提高和化學(xué)防腐劑殘留問題的凸顯，人們對天然防腐劑的需求不斷增加，因此安全高效的天然植物源防腐劑受到廣泛關(guān)注[1]，其中，天然食用香辛料具有抑菌、抗氧化作用[2,3]，其防腐保鮮研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)。迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)，屬唇形科迷迭香屬植物，是一種具有悠久栽培歷史和食用歷史的天然香料植物[4]。迷迭香中有效成分為迷迭香酸、迷迭香酚、鼠尾草酸、鼠尾草酚和熊果酸等，具有抑菌、抗氧化、消炎等功效[5-8]。迷迭香提取物已被列入歐盟有機(jī)食品添加劑名單[9]。目前，關(guān)于迷迭香中抑菌成分的研究主要集中于提取方法 以及在食品防腐保鮮和抗氧化方面的應(yīng)用[10-18]，而未見其抑菌穩(wěn)定性的研究報(bào)道。本文旨在對迷迭香提取液的抑菌作用、最小抑菌濃度及影響抑菌穩(wěn)定性的因素進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期為迷迭香開發(fā)成安全高效的天然食品防腐劑和抗氧化劑并運(yùn)用于食品防腐保鮮提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

迷迭香：產(chǎn)地云南，購自揚(yáng)州眾成堂大藥房；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢桿菌：均由揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供；平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、酵母粉、牛肉浸膏、瓊脂；無水乙醇、氫氧化鈉、濃鹽酸、丙酸、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鐵、硫酸亞鐵：均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能粉碎機(jī) 永康市鉑歐五金制品有限公司；JA2003N電子天平 上海精密儀器有限公司；PHS-3G酸度計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；JY92-IIDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DHG-9003電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HPX-80生化培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 迷迭香提取液的制備

采用超聲波輔助提取獲得迷迭香提取液。迷迭香干燥后粉碎，過80目篩。準(zhǔn)確稱取一定量的粉末，按照料液比1∶10加入80%乙醇溶液，置于超聲波細(xì)胞粉碎儀中，恒溫50 ℃，浸提50 min。采用真空泵抽濾，收集濾液，真空低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，制得迷迭香提取液。

1.3.2 菌懸液的制備

將實(shí)驗(yàn)室提供的菌種進(jìn)行活化，用平板稀釋法測定菌落總數(shù)?；罨蟮募?xì)菌用無菌生理鹽水稀釋為含菌數(shù)5×108CFU/mL的菌懸液。

1.3.3 抑菌圈的測定

通過瓊脂打孔法測定提取液抑菌圈[19]。采用雙層平板法，即先倒入10 mL左右培養(yǎng)基，冷卻凝固后，滴加100 μL菌懸液于平板上，再倒入5 mL培養(yǎng)基充分混勻。用直徑為6 mm的瓊脂打孔器均勻打孔，各取50 μL提取液至孔中。將培養(yǎng)皿正置放于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。每組重復(fù)3次，取平均值。設(shè)置無菌水作陰性對照。

1.3.4 最低抑菌濃度

采用二倍稀釋法[20]，將迷迭香提取液(500 mg/mL)用無菌水稀釋為原液的100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125% 6個(gè)濃度(即提取液濃度分別為500.0，250.0，125.0，62.50，31.25，15.625 mg/mL)，分別吸取1 mL不同稀釋度的提取液至無菌平皿中，再加15 mL培養(yǎng)基，充分混合均勻。待培養(yǎng)基冷卻凝固后，取100 μL供試菌懸液于平板上，均勻涂布。將培養(yǎng)皿倒置放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察供試菌生長狀況，每組重復(fù)3次。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Graphpad Prism 7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 迷迭香提取液的抑菌作用

迷迭香中含有迷迭香酸、迷迭香酚、鼠尾草酸、鼠尾草酚等抑菌成分，對超聲波提取的迷迭香提取液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，迷迭香提取液對食品中常見的腐敗菌和致病菌的抑菌效果見圖1。

圖1 迷迭香提取液對食品中常見細(xì)菌的抑菌效果

由圖1可知，迷迭香提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有較好的抑菌效果，形成明顯的抑菌圈。迷迭香提取液對大腸桿菌的抑菌圈直徑為16.4 mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為19.2 mm，對表皮葡萄球菌的抑菌圈直徑為33.7 mm，對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為22.1 mm。

2.2 迷迭香提取液的最低抑菌濃度

采用二倍稀釋法研究迷迭香提取液的最低抑菌濃度。不同濃度的迷迭香提取液對4種供試菌的抑菌效果見表1和圖2。

表1 迷迭香提取液的最低抑菌濃度

圖2 不同濃度的迷迭香提取液的抑菌效果

由表1和圖2可知，通過比較不同平皿的受試菌生長情況，迷迭香提取液對不同菌種有不同的最低抑菌濃度。迷迭香提取液濃度不低于62.50 mg/mL時(shí)，均可以有效地抑制受試細(xì)菌的生長，當(dāng)濃度稀釋到31.25 mg/mL時(shí)，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌出現(xiàn)菌落；當(dāng)濃度稀釋到15.625 mg/mL時(shí)，枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌出現(xiàn)少量的菌落。因此，迷迭香提取液對枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌的抑菌作用大于對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用，并且對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最低抑菌濃度為62.50 mg/mL，對枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌的最低抑菌濃度為31.25 mg/mL。

2.3 熱處理對迷迭香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

熱處理是食品加工過程中的常用工序。將迷迭香提取液分別在65，80，100，121 ℃下處理 30 min，以未處理過的提取液作對照，分別對供試菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，以確定其抑菌作用的熱穩(wěn)定性，結(jié)果見圖3。

圖3 熱處理對迷迭香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖3可知，經(jīng)過不同溫度的熱處理，迷迭香提取液的抑菌作用變化不明顯。經(jīng)過65，80，100 ℃的熱處理，提取液對4種供試菌的抑菌圈直徑變化趨勢平緩，變化幅度不超過6.2%，抑菌作用穩(wěn)定，抑菌效果較好。121 ℃處理后，提取液的抑菌圈直徑略減小，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌的抑菌圈減幅分別為8.5%、6.3%、9.5%、9.2%，抑菌效力略降低，但仍保持良好的抑菌效果，表明迷迭香提取液具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，能夠適應(yīng)食品加工過程中的多種熱處理?xiàng)l件。

2.4 pH對迷迭香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

不同的食品，pH也不同。用丙酸溶液和NaOH溶液將提取液的 pH 分別調(diào)為 2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，以未處理的提取液(pH為6.4)作對照，分別對供試菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，以確定pH對提取液抑菌作用的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，迷迭香提取液的抑菌效果受pH的影響，且變化顯著。與對照相比，當(dāng)pH值為2.0時(shí)，提取液的抑菌圈直徑明顯減小，減幅分別為大腸桿菌 32.9%、金黃色葡萄球菌37.5%、枯草芽孢桿菌34.1%、表皮葡萄球菌29.1%，抑菌活力降低明顯；當(dāng)pH值為4.0～6.0時(shí)，提取液抑菌圈直徑略有增加，抑菌活力強(qiáng)、效果好；當(dāng)pH值為8.0時(shí)，抑菌圈直徑減小，金黃色葡萄球菌減小最明顯，降幅為19.6%，表皮葡萄球菌降幅最小(8.0%)，提取液抑菌活力下降；當(dāng)pH值為10時(shí)，抑菌圈直徑顯著減小，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌的減幅分別為39.5%、42.2%、21.7%、27.5%，抑菌活力顯著降低，抑菌效果較差。表明迷迭香提取液在弱酸性及中性條件時(shí)抑菌作用強(qiáng)，但是在強(qiáng)酸性、堿性環(huán)境下抑菌效果較差。因此，將迷迭香提取液應(yīng)用于食品保鮮時(shí)，應(yīng)避免強(qiáng)酸或堿性條件。

圖4 pH對迷迭香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

2.5 紫外照射對迷迭香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

將迷迭香提取液分別在紫外燈下照射10，20，30，40 min，以未處理的提取液作對照，分別對供試菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，以確定紫外照射對提取液抑菌穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 紫外照射時(shí)間對迷迭香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖5可知，經(jīng)過不同時(shí)長的紫外照射處理，迷迭香提取液的抑菌圈直徑變化趨勢平緩，提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌的抑菌圈直徑變化幅度分別小于6.3%、9.4%、8.0%、7.4%，抑菌效果基本無變化，抑菌作用穩(wěn)定。表明迷迭香提取液抑菌性對紫外照射的穩(wěn)定性較好。

2.6 金屬離子對迷迭香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

將迷迭香提取液分別加入K+、Na+、Ca2+、Fe2+、Fe3+等，以未處理的提取液作對照，分別對供試菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，以確定金屬離子對提取液抑菌穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 金屬離子對迷迭香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖6可知，迷迭香提取液加入K+、Na+、Ca2+、Fe2+、Fe3+等金屬離子后，提取液的抑菌圈直徑變化趨勢平緩，變化幅度分別為大腸桿菌 6.8%、金黃色葡萄球菌8.3%、枯草芽孢桿菌5.7%、表皮葡萄球菌7.4%，抑菌活性較穩(wěn)定。表明迷迭香提取液的抑菌作用對金屬離子的穩(wěn)定性較好，在加工中幾乎不受金屬離子的影響。

3 結(jié)論

迷迭香中有效抑菌成分主要是迷迭香酸、迷迭香酚、鼠尾草酸、鼠尾草酚等物質(zhì)。迷迭香提取液對食品中常見的致病菌抑制作用明顯，對大腸桿菌的抑菌圈直徑為16.4 mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為19.2 mm，對表皮葡萄球菌的抑菌圈直徑為33.7 mm，對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為22.1 mm，并且對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最低抑菌濃度為62.50 mg/mL，對枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌的最低抑菌濃度為31.25 mg/mL。

通過抑菌穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，迷迭香提取液具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，在酸性和中性條件下穩(wěn)定性好，但在強(qiáng)酸和堿性條件下較不穩(wěn)定，紫外和大多數(shù)金屬離子均不影響其抑菌效果，因此，迷迭香可以適應(yīng)多種加工條件，可廣泛用于食品的防腐保鮮。

迷迭香來源廣、易獲取，將迷迭香提取后經(jīng)過工藝調(diào)整運(yùn)用到食品防腐保鮮中既可改善食品感官品質(zhì)，也利于消費(fèi)者身體健康，因此開發(fā)迷迭香防腐劑具有較好的應(yīng)用前景。