張鈺皎，陳忠軍，滿都拉，孫子羽，蘇杰，金晶晶，胡煒東，*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014109）

乳桿菌是一類革蘭氏陽(yáng)性、無芽孢桿菌，可以發(fā)酵糖類（主要指葡萄糖）產(chǎn)生大量乳酸[1]。其具有維持腸道菌群平衡、促進(jìn)腸道吸收、預(yù)防腫瘤、降低膽固醇、增強(qiáng)免疫力和預(yù)防衰老的功效。乳桿菌生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸、過氧化氫等次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)食品中的腐敗菌具有一定抑制作用，因此其代謝產(chǎn)物常被用作食品加工和保藏過程中的天然防腐劑[2-4]。

細(xì)菌生物被膜（biofilm）是細(xì)菌適應(yīng)脅迫環(huán)境的一種生存方式。食源性病原菌可以黏附于食品接觸表面進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖而形成生物被膜[5]。食源性病原菌生物被膜不僅會(huì)對(duì)食品加工設(shè)備、加工廠地板和墻壁表面等造成污染，還會(huì)導(dǎo)致食品的交叉污染、保質(zhì)期降低等問題。病原菌形成生物被膜后對(duì)抗生素和抑菌劑的抵抗作用加強(qiáng)，較難以被清除[6]。金黃色葡萄球菌（Stap-hylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）和沙門氏菌（Salmonella）是重要的食源性病原菌。在食品加工過程中，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌不僅能單獨(dú)形成生物被膜，還能聯(lián)合形成混合菌生物被膜[7]。

群體感應(yīng)系統(tǒng)（quorum sensing，QS）是微生物通過分泌整合特定的信號(hào)分子，以啟動(dòng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和生物被膜形成等行為的一種通訊機(jī)制[8]。AI-2信號(hào)分子廣泛存在于革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌中，其不僅可介導(dǎo)種間交流，還可介導(dǎo)不同菌屬間的相互交流[9-10]。因此，AI-2信號(hào)分子介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)在食源性病原菌生物被膜的建立和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。

本研究選用從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選的5株乳桿菌，通過雙層平板法、結(jié)晶紫染色法及AI-2分子活性測(cè)定，確定其所產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的單一菌生物被膜和混合菌生物被膜形成的干預(yù)作用。旨在尋求一種在食品加工和保藏過程中能有效控制病原菌生物被膜的天然抑菌劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

乳桿菌（菌株編號(hào) ALAC-1、ALAC-2、ALAC-3、ALAC-4、ALAC-5）：分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵食品；大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 11775-3、沙門氏菌（Salmonella）ATCC 14028、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC 26003-3、哈維弧菌（V.harveyi BB170）：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 試劑

NaCl、MgSO4、KOH、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、精氨酸、甘油：分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250溶液：廣東環(huán)凱微生物科技公司。

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（tryptonesoybroth，TSB）、MRS培養(yǎng)基、水瓊脂培養(yǎng)基：北京陸橋生物技術(shù)有限公司；AB 培養(yǎng)基：0.3 mol/L NaCl，0.05 mol/L MgSO4，0.2%酸水解酪蛋白，用KOH調(diào)節(jié)pH值至7.5，121℃高壓滅菌20 min，冷卻后每100 mL培養(yǎng)基中加入1 mL 1mol/L PBS，1mL 0.1mol/L精氨酸和2 mL 50%甘油。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2DF（標(biāo)準(zhǔn)型）雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Synergy H1全功能微孔板檢測(cè)儀：美國(guó)伯騰儀器有限公司；LDZX全自動(dòng)高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SHB-III循環(huán)水真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；JY系列電子天平：上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；GHP隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV752紫外可見光分光光度計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司；NU-C200R-E離心機(jī)：北京布拉德科技發(fā)展有限公司；XH-C漩渦混勻器：常州未來儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳桿菌代謝產(chǎn)物的制備

乳桿菌ALAC-1、ALAC-2、ALAC-3、ALAC-4、ALAC-5活化3代后，將菌懸液以4%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃厭氧培養(yǎng)24 h；4 000 r/min離心10 min后取上清液，0.22 μm濾膜過濾后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中（45℃～55℃）濃縮至25倍；加入飽和硫酸銨溶液使?jié)饪s物飽和度達(dá)60%，4℃放置過夜。離心（12 000 r/min，20 min，4℃）取沉淀，無菌PBS溶液溶解后得乳桿菌蛋白粗提液[11-12]。

1.3.2 指示菌菌懸液的制備

大腸桿菌ATCC 11775-3、金黃色葡萄球菌CMCC 26003-3、沙門氏菌ATCC 14028于37℃下活化后，無菌PBS梯度稀釋至OD600nm=0.1，備用。

1.3.3 Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

以0.1 mg/mL牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按表1所示加入相應(yīng)試劑，漩渦振蕩混勻后室溫（約25℃）靜置2 min，以0號(hào)管作為空白對(duì)照，于595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，以牛血清蛋白含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線所有試劑Table 1 Reagents used in standard curve

0.1 mL待測(cè)樣品，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250，混勻并室溫（約為25℃）靜置2 min后于波長(zhǎng)595 nm下測(cè)定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品蛋白質(zhì)含量。

1.3.4 乳桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)3株病原菌浮游菌活性的測(cè)定

雙層平板法測(cè)定抑菌性：水瓊脂培養(yǎng)基倒板，待板凝固后用鑷子將無菌牛津杯置于水瓊脂上；無菌生理鹽水將3株指示菌梯度稀釋至103CFU/mL；1 mL指示菌液加入到25 mL TSB瓊脂培養(yǎng)基，搖勻后倒入平皿中，凝固后取出牛津杯；于牛津杯里加入200 μL乳桿菌蛋白粗提液，37℃培養(yǎng)24 h后量取抑菌圈直徑[14]。

1.3.5 乳桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)單一菌和混合菌生物被膜形成的影響

1.3.5.1 乳桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)單一菌生物被膜形成的影響

200 μL TSB 培養(yǎng)基（含 5 株終濃度為 40、50、60、70、80 μg/mL的乳桿菌蛋白粗提液）加入96孔微量板中，將OD600nm=0.1的3株病原菌菌懸液分別按照體積比1∶100接種于96孔板中，37℃下培養(yǎng)24 h后棄去菌液。每孔加入300 μL磷酸鹽緩沖液沖洗3次去除浮游菌；用200 μL無水甲醇固定15 min后棄液，60℃下干燥1 h；加入200 μL 2%結(jié)晶紫染液染色20 min，蒸餾水洗去多余染液；干燥后加入300 μL 33%冰醋酸反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定630 nm下的吸光值[15]。平行試驗(yàn)3次，抑制率計(jì)算公式為：

1.3.5.2 乳桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)混合菌生物被膜形成的影響

OD600nm=0.1的3株病原菌菌懸液按體積比1∶1∶1混合后以1%的接種量接種于96孔板中，乳桿菌蛋白代謝物加量及生物被膜培養(yǎng)測(cè)定方法同1.3.5.1。

1.3.6 乳桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌群體感應(yīng)信號(hào)分子的影響

1.3.6.1 乳桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)單一菌AI-2分子釋放的影響

將10 μL OD600nm=0.1的3株病原菌分別接種于1 mL TSB培養(yǎng)基（含終濃度為60 μg/mL乳桿菌代謝產(chǎn)物），37℃培養(yǎng)8 h后離心（12 000 r/min，10 min）取上清液，0.22 μm濾膜過濾后保存于4℃冰箱。AI-2分子的報(bào)告菌株V.harveyi BB170于30℃搖床轉(zhuǎn)速200 r/min培養(yǎng)過夜，用新鮮AB培養(yǎng)基以1∶5 000（體積比）稀釋V.harveyi BB170培養(yǎng)物。96孔板的每孔中加入10 μL含乳桿菌的過濾液和100 μL稀釋后的AB培養(yǎng)液，同時(shí)以不加乳桿菌的稀釋液上清液做對(duì)照。于30℃、200 r/min下培養(yǎng)，酶標(biāo)儀每隔1 h測(cè)一次發(fā)光值，直至5 h，平行試驗(yàn)3次。試驗(yàn)結(jié)果以相對(duì)活性強(qiáng)度表示，即試驗(yàn)組上清液的發(fā)光強(qiáng)度與陽(yáng)性對(duì)照組的發(fā)光強(qiáng)度之比，當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照組的發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大時(shí)，設(shè)此時(shí)的相對(duì)活性強(qiáng)度為100%[16]。

1.3.6.2 乳桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)混合菌AI-2分子釋放的影響

將OD600nm=0.1的3株病原菌以體積比1∶1∶1混合后，取10 μL接種于1 mL TSB培養(yǎng)基（含終濃度為60 μg/mL乳桿菌代謝產(chǎn)物），37℃培養(yǎng)8 h后離心（12 000 r/min，10 min） 取上清液，0.22 μm 濾膜過濾后保存于4℃冰箱。混合菌AI-2信號(hào)分子相對(duì)活性強(qiáng)度的測(cè)定同1.3.6.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

以0.1 mg/mL牛血清蛋白溶液為標(biāo)準(zhǔn)溶液，以牛血清蛋白含量為橫坐標(biāo)，A595為縱坐標(biāo)繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Protein standard curve

該曲線線性回歸方程為：Y=0.005x+0.037 3，R2=0.995 3，表明標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液濃度在0～100 μg/mL的線性關(guān)系良好。

2.2 牛津杯法測(cè)定抑菌活性

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌為指示菌，測(cè)定5株乳桿菌的抑菌活性，結(jié)果見表2。

表2 5株乳桿菌的抑菌效果Table 2 Antibacterial activity of five Lactobacillus mm

如表2所示，5株乳桿菌蛋白粗提液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌均有抑制作用。其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最強(qiáng)，沙門氏菌和大腸桿菌次之，且抑菌強(qiáng)度均為ALAC-5＞ALAC-1＞ALAC-2＞ALAC-4＞ALAC-3。

2.3 乳桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)單一菌和混合菌生物被膜形成的影響

于事先裝有 ALAC-1、ALAC-2、ALAC-3、ALAC-4、ALAC-5代謝產(chǎn)物的TSB培養(yǎng)基中分別接種食源性細(xì)菌（金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌）及其混合菌，37℃下培養(yǎng)24 h后通過結(jié)晶紫染色法測(cè)定其生物被膜的形成能力，結(jié)果見圖2。

圖2 乳桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌生物被膜形成能力的影響Fig.2 Effect of Lactobacillus metabolites on biofilm formation ability of pathogenic bacteria

由圖 2 可知，ALAC-1、ALAC-2、ALAC-3、ALAC-4和ALAC-5代謝產(chǎn)物均可抑制3株病原菌及其混合菌生物被膜的形成，且生物被膜的形成力隨著粗提液蛋白含量的增大而逐漸減弱。ALAC-5代謝產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌及其混合菌的成膜能力抑制率最高，ALAC-4最弱。在未添加乳桿菌代謝產(chǎn)物時(shí)，金黃色葡萄球菌生物被膜在630 nm下的吸光度為 0.095±0.005 3，大腸桿菌 0.16±0.004，沙門氏菌0.093±0.002 6，混合菌 0.073±0.001，混合菌生物被膜的OD值明顯低于3株病原菌單獨(dú)形成的生物被膜，這是因?yàn)樵诨旌暇锉荒ぶ校锾m氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌間存在競(jìng)爭(zhēng)作用，使得膜中各菌株數(shù)量明顯減少。Rüger M等[17]通過對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的混合菌生物被膜研究發(fā)現(xiàn)，不同菌株間的拮抗性使得其生長(zhǎng)速度及數(shù)量明顯減弱。Millezi F等[18]研究發(fā)現(xiàn)在雙菌種生物膜中，大腸桿菌會(huì)降低金黃色葡萄球菌的易感性。

當(dāng)乳桿菌代謝產(chǎn)物中的蛋白含量為80 μg/mL時(shí)，ALAC-1、ALAC-5對(duì)大腸桿菌生物被膜的抑制率最強(qiáng)，分別為 63.67%、66.39%，菌株 ALAC-2、ALAC-3次之，抑制率分別為61.80%、51.98%，ALAC-4最弱，為49.27%；對(duì)沙門氏菌生物被膜抑制率大小為：ALAC-5（74.91%）＞ALAC-1（65.23%）＞ALAC-2（56.99%）＞ALAC-4（45.16%）＞ALAC-3（40.50%），相比大腸桿菌，沙門氏菌對(duì)ALAC-5和ALAC-1敏感性較強(qiáng)，對(duì)其余4株較弱之；ALAC-5對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制率高達(dá)78.95%，其余4株抑制作用同大腸桿菌，即 ALAC-1（69.47%）＞ALAC-2（51.23%）＞ALAC-3（45.61%）＞ALAC-4（36.49%），但 ALAC-2、A LAC-3和ALAC-4對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用低于大腸桿菌和沙門氏菌；混合菌生物被膜抑制率為ALAC-5（51.82%）＞ALAC-1（44.55%）＞ALAC-2（39.10%）＞ALAC-3（32.72%）＞ALAC-4（31.36%），混合菌生物被膜對(duì)乳桿菌代謝產(chǎn)物的抗性高于3株單一菌生物被膜，因?yàn)榛旌暇锉荒ぶ懈鱾€(gè)菌株分泌胞外多糖等物質(zhì)的多樣性，使得菌株間的黏連作用及相互作用力更強(qiáng)，較難以被外界不利因素所影響，增加了混合菌生物被膜的耐藥性[19-20]。

2.4 乳桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌AI-2活性的影響

通過報(bào)告菌株V.harveyi BB170的生物發(fā)光值，測(cè)定了5株乳桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌及其混合菌AI-2信號(hào)分子活性的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 乳桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌AI-2活性的影響Fig.3 Effect of Lactobacillus metabolites on activity of pathogenic AI-2

V.harveyi BB170可調(diào)控群體感應(yīng)信號(hào)分子AI-2，菌株上清液中的AI-2分子的含量越高，發(fā)光強(qiáng)度越大[21]。由圖3可知，5株乳桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)3株病原菌及其混合菌的AI-2相對(duì)活性均有影響，相比空白對(duì)照，添加了乳桿菌代謝產(chǎn)物的上清液AI-2分子活性明顯降低。添加了ALAC-1、ALAC-5代謝產(chǎn)物的大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及其混合菌的AI-2信號(hào)分子活性最低，說明這2株乳桿菌對(duì)病原菌的抑制作用最強(qiáng)，再次佐證了分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的乳桿菌對(duì)病原菌的抑制作用。

3 結(jié)論

本研究以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌為指示菌，研究了內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選的乳桿菌 ALAC-1、ALAC-2、ALAC-3、ALAC-4 和 ALAC-5代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌及其生物被膜的抑制作用，并通過群體感應(yīng)信號(hào)分子AI-2相對(duì)活性的檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)了乳桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌的抑制作用。結(jié)果表明，5株乳桿菌對(duì)單一菌和混合菌生物被膜均有抑制作用，且隨著代謝產(chǎn)物中蛋白濃度的增加，生物被膜的形成能力逐漸減弱；ALAC-1和ALAC-5代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌生物被膜及其AI-2活性抑制效果最好。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌是食品工業(yè)中最常見的食源性病原菌，同時(shí)也是引起食品污染及腐敗的主要污染菌，大量研究表明，這些細(xì)菌可形成生物被膜以增加對(duì)不良環(huán)境條件的抗性，給食品加工生產(chǎn)與人們的生活帶來不便。因此本試驗(yàn)從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選了具有抑菌作用的乳桿菌，研究其對(duì)病原菌及其生物被膜的抑制作用，不僅為食品實(shí)際生產(chǎn)提供了一種天然防腐劑，也為之后篩選乳桿菌抑菌基因提供了理論基礎(chǔ)。