張夢薇，劉舒雯，胡江峰，張健

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

赭曲霉毒素（ochratoxin）是由很多曲霉屬和青霉屬真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物[1-3]，其具有腎毒性、肝毒性、致癌性、致畸性和免疫抑制作用，會對人類健康造成嚴(yán)重危害，其中毒性最強(qiáng)的赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）已被證明在腎臟和肝臟中具有致癌性[4-6]。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)和世界衛(wèi)生組織將其歸類為2B類致癌物[7]。OTA會污染多種食品，在谷物、葡萄酒、咖啡豆、豆類、香料、肉類和奶酪產(chǎn)品以及其他飲料（例如啤酒）中都檢測到了OTA的存在[8-11]。這不僅造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也對人類健康造成威脅。因此需要研究制定有效的防治措施，最大程度地降低毒素合成，保護(hù)人類健康。

黑曲霉（Aspergillus niger）是自然界中廣泛存在的一種曲霉屬真菌，通常被認(rèn)為是安全的（generally recognized as safe，GRAS）[12]，是工業(yè)生產(chǎn)中使用的最重要的真菌之一，被廣泛用于胞外酶、有機(jī)酸等工業(yè)生產(chǎn)中[13-15]，同時(shí)也被用作異源蛋白質(zhì)和次級代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化宿主[14，16-17]。然而Abarca等發(fā)現(xiàn)某些黑曲霉菌株能夠產(chǎn)生致癌的真菌毒素赭曲霉毒素A[18]。近年來，研究人員陸續(xù)在櫻桃、咖啡豆、葡萄、腌肉制品、飼料和多種谷物中發(fā)現(xiàn)了一些可以產(chǎn)生OTA的黑曲霉[19]。這不僅影響了黑曲霉的工業(yè)應(yīng)用，也加深了黑曲霉污染農(nóng)產(chǎn)品的危害。因此，迫切需要有效的策略來預(yù)防黑曲霉感染和霉菌毒素的產(chǎn)生。

目前已有大量的研究致力于闡明OTA的生物合成途徑及其分子的調(diào)控機(jī)制。然而OTA生物合成基因簇的邊界和組成仍然沒有完全確定，其具體的合成機(jī)制尚不清楚[20]。OTA作為一種次級代謝產(chǎn)物，除了會受到簇內(nèi)特異性調(diào)控因子調(diào)控，還受簇外的全局調(diào)控因子調(diào)控。veA是在構(gòu)巢曲霉中被發(fā)現(xiàn)的一種全局調(diào)控因子[21]，后來，在多種真菌中鑒定了veA直系同源物，并證明其在真菌發(fā)育和次級代謝中起重要作用。Crespo-Sempere A等發(fā)現(xiàn)veA可以在碳黑曲霉中調(diào)控OTA產(chǎn)生，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在黑曲霉中veA基因的缺失幾乎消除了OTA的產(chǎn)生[22-23]。本研究以產(chǎn)OTA的黑曲霉CICC 41702為出發(fā)菌株構(gòu)建黑曲霉veA過表達(dá)菌株，揭示過表達(dá)veA基因?qū)谇股L發(fā)育和OTA生物合成的影響，為赭曲霉毒素基因簇的鑒定提供理論依據(jù)，并為有效地控制黑曲霉產(chǎn)毒污染提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

赭曲霉毒素產(chǎn)生菌黑曲霉 CICC 41702（Aspergillus niger CICC 41702）、 大 腸 桿 菌 DH5α（Escherichia coli DH5α）、根癌農(nóng)桿菌 AGL1（Agrobacterium tumefaciens AGL1）及雙元穿梭質(zhì)粒p44：天津科技大學(xué)生化過程與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存；veA基因過表達(dá)質(zhì)粒p44-OE：：veA、OE：：veA 突變株：天津科技大學(xué)生化過程與技術(shù)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建。

1.1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶 Pst I和EcoR-I、TaKaRaTaq酶、PrimeSTARMaxPremix 酶、DL5000DNAMaker、DL10000 DNA Maker：TaKaRa 公司；2×Rapid Taq Master Mix、ClonExpressMultis重組克隆試劑盒、HiScript II Q RT SuperMix for qPCR、ChamQ SYBR qPCR Master Mix：Vazyme公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒：北京索來寶生物科技有限公司；化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

大腸桿菌和農(nóng)桿菌培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為細(xì)菌培養(yǎng)基LB（lysogeny broth），黑曲霉培養(yǎng)過程中用到的培養(yǎng)基包括：完全培養(yǎng)基CM（complete medium）和察氏培養(yǎng)基CYA（czapek yeast exatract），具體配置方法參照文獻(xiàn)[24]。

1.1.4 儀器與設(shè)備

HPLC-FLD 1200：德國安捷倫公司；LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；PCR基因擴(kuò)增儀：美國BIO-RAD公司；LRH-250-A生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；AQ-C18色譜柱：日本島津儀器有限公司；LC480Ⅱ熒光定量PCR儀：Roche公司；OLYMPUS 719068光學(xué)顯微鏡：OLYMPUS公司。

1.1.5 引物

研究所使用的引物如表1所示。

表1 本研究用引物Table 1 Primers used in this study

續(xù)表1 本研究用引物Contimue table 1 Primers used in this study

1.2 veA基因的克隆與序列分析

參考國家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI） 公 布 的 黑 曲 霉CBS513.88中veA的基因序列（編號：XP-001392627.1），設(shè)計(jì)引物veA-F/veA-R，以黑曲霉CICC 41702基因組為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增以獲得veA基因。PCR反應(yīng)條件：95℃5min；95℃30s，60.8℃30s，72℃110 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。利用1%瓊脂糖凝電泳檢測PCR產(chǎn)物，切膠回收純化后的DNA片段送至金維智測序公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與NCBI上公布的序列進(jìn)行比對。并利用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列比對，并在網(wǎng)站https：//web.expasy.org/protparam/上推算該蛋白的等電點(diǎn)、分子量。

1.3 OE：：veA過表達(dá)菌株的構(gòu)建

以黑曲霉CICC 41702基因組為模板，利用引物veA-F/veA-R擴(kuò)增veA基因；利用引物ku70Z-F/ku70Z-R及ku70Y-F/ku70Y-R分別擴(kuò)增ku70基因的同源左右臂，將同源左右臂分別命名為HR1和HR2；利用引物PgpdA-F/PgpdA-R擴(kuò)增PgpdA啟動子、利用引物Tgla-F/Tgla-R擴(kuò)增Tgla終止子；以實(shí)驗(yàn)室保存的p44質(zhì)粒為模板，利用引物hyg-F/hyg-R擴(kuò)增hyg?；厥占兓笏?veA、HR1、HR2、PgpdA、Tgla、hyg 片段，通過融合PCR的方法，利用引物PgpdA-F/veA-R將PgpdA、veA片段融合成單條片段PgpdA-veA，先利用EcoR I和Pst I雙酶切P44質(zhì)粒，再利用ClonExpressMultis多片段拼接無縫克隆技術(shù)將HR1、HR2、PgpdA-veA、Tgla、hyg連接至質(zhì)粒p44，從而獲得完成最終質(zhì)粒p44-OE：：veA的構(gòu)建（圖1）。將過表達(dá)質(zhì)粒p44-OE：：veA通過電轉(zhuǎn)化的方法，導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌AGL1中，利用含有p44-OE：：veA質(zhì)粒根癌農(nóng)桿菌AGL1侵染黑曲霉，提取黑曲霉轉(zhuǎn)化子基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證，篩選出在ku70基因處過表達(dá)veA基因的黑曲霉轉(zhuǎn)化子。過表達(dá)veA基因的流程圖如圖2所示。

圖1 p44-OE：：veA質(zhì)粒圖譜Fig.1 Vector map of p44-OE：：veA

圖2 veA基因在ku70處過表達(dá)流程圖Fig.2 The schematic of veA gene overexpression at ku70 gene in A.niger

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定veA基因表達(dá)量變化

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，利用引物RTPCRveA-F/RT-PCRveA-R，檢測出發(fā)菌株與 OE：：veA突變株在CYA液體培養(yǎng)基中生長到第3天時(shí)veA基因的相對表達(dá)量，并以β-actin基因（引物β-actin-F/β-actin-R）作為內(nèi)參基因。具體操作過程參考本課題組之前的方法[23]。

1.5 出發(fā)菌株與OE：：veA突變株菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)及生長速率的差異

取 1 μL（1×107個(gè)/mL）出發(fā)菌株與 OE：：veA 突變菌株的孢子懸液接種到CYA平板中央，各3組平行，25℃培養(yǎng)7 d，每隔24 h觀察菌落形態(tài)并測量菌落的直徑。將孢懸稀釋到106個(gè)/mL，分別吸取5 μL孢懸至玻璃片與CYA培養(yǎng)基的縫隙中，培養(yǎng)48 h，各3個(gè)平行，至長出菌絲，隨后將玻璃片取出置于載玻片上用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲形態(tài)。

1.6 出發(fā)菌株與OE：：veA突變株產(chǎn)赭曲霉毒素含量的比對

分別吸取1 mL（1×107個(gè)/mL）混勻的黑曲霉出發(fā)菌株與OE：：veA突變株的孢子懸液，分別接種到100mL CYA液體培養(yǎng)基中，各做3個(gè)平行，25℃避光靜置培養(yǎng)，吸取適量的培養(yǎng)液用孔徑為0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，并利用高效液相色譜熒光檢測器（high-performance liquid chromatography with fluorescence detection，HPLC-FLD）檢測赭曲霉毒素，檢測條件：KromstarTMHPLC 反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；激發(fā)波長：333 nm，發(fā)射波長：460 nm；流動相乙腈∶水∶醋酸=99∶99 ∶2（體積比）；流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量為 20 μL。

1.7 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)測定3次，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差方式表示，采用Excel 2003軟件處理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 veA基因的克隆及序列分析

以黑曲霉出發(fā)菌株CICC 41702基因組為模板，用引物veA-F/veA-R，擴(kuò)增veA同源基因，將其連接到pMD18-T載體上，送至金維智測序。測序結(jié)果表明該基因與NCBI公布的黑曲霉CBS513.88的veA基因序列完全相同。該基因由555個(gè)氨基酸編碼組成，預(yù)測veA蛋白預(yù)測分子量為61 317.65，等電點(diǎn)為9.69。

2.2 OE：：veA過表達(dá)菌株的構(gòu)建

以hyg（抗性基因）篩選黑曲霉轉(zhuǎn)化子，從而獲得含有目的片段的轉(zhuǎn)化子，最終得到在ku70處過表達(dá)veA基因的菌株。使用引物ku70Z-F/ku70Y-R對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證。若黑曲霉轉(zhuǎn)化子基因組上ku70左右臂之間原始片段被目的片段替換，則出發(fā)菌株和正確轉(zhuǎn)化子將擴(kuò)增出長度不同的單一條帶。如果目的片段在基因組上隨機(jī)插入，會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增出兩條長度不同的雙帶（ku70基因組本身的3 884 bp條帶和表達(dá)元件6 726 bp目的條帶）。結(jié)果如圖3所示。15號泳道為正確的陽性黑曲霉轉(zhuǎn)化子，由此成功獲得在ku70處過表達(dá)veA基因的菌株。

圖3 黑曲霉轉(zhuǎn)化子的PCR驗(yàn)證Fig.3 The A.niger transformants confirmed by the PCR method

2.3 出發(fā)菌株與OE：：veA突變株中veA基因表達(dá)量變化比較

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測第3天即OTA剛開始生成時(shí)veA基因的相對表達(dá)量，結(jié)果如圖4所示。

圖4 veA基因的相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression of veA gene

OE：：veA菌株中veA基因的表達(dá)量是出發(fā)菌株中veA基因表達(dá)量的299%，大大提高了veA基因在黑曲霉中的表達(dá)量。證實(shí)了veA基因過表達(dá)元件已在黑曲霉中正常的進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.4 出發(fā)菌株與OE：：veA菌株菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)及生長速率差異比較

出發(fā)菌株與OE：：veA菌株菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)及生長速率差異見圖5。

出發(fā)菌株與OE：：veA菌株菌落形態(tài)的生長情況結(jié)果圖5A所示，出發(fā)菌株及OE：：veA菌株的菌落中間有大量棕色孢子產(chǎn)生，邊緣菌絲呈乳黃色，菌落邊緣整齊。與出發(fā)菌株相比，OE：：veA菌株的菌絲顏色變淺呈淺黃色，且菌絲有些許透明，菌落中間呈現(xiàn)更多褶皺。在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)與出發(fā)菌株相比OE：：veA突變株菌絲枝節(jié)較少，菌絲長度變短且菌絲整體疏散但有更多的分生孢子頭（圖5B）。通過測量菌株生長過程中的菌落直徑（圖5C），發(fā)現(xiàn)出發(fā)菌株與OE：：veA菌株生長速率差別不大。

圖5 出發(fā)菌株及OE：：veA菌株的表型分析Fig.5 Phenotypic analysis of starting strain and the OE：：veA mutant strains

2.5 出發(fā)菌株與OE：：veA突變株產(chǎn)赭曲霉毒素分析

培養(yǎng)5 d的出發(fā)菌株與OE：：veA突變株產(chǎn)赭曲霉毒素HPLC-FLD的檢測見圖6。

圖6HPLC-FLD圖Fig.6HPLC-FLD chromatograms

由圖6可知，出發(fā)菌株與OE：：veA菌株都可以檢測到OTβ，OTα、OTB以及OTA的峰，出峰時(shí)間分別為3.567、3.884、7.149、11.340 min，與出發(fā)菌株相比，OE：：veA菌株中，OTβ，OTα、OTB以及OTA 的含量顯著降低。出發(fā)菌株在培養(yǎng)過程中，OTA含量均持續(xù)增加，而OE：：veA菌株在培養(yǎng)過程中OTA含量較低且基本保持一致。在培養(yǎng)5、6、7 d過程中，與出發(fā)菌株對比，OE：：veA菌株 OTA含量相對減少 46%、63.33%、75.81%，呈下降趨勢，結(jié)果見圖7。

圖7 出發(fā)菌株及OE：：veA菌株OTA生物合成變化Fig.7 OTA biosynthesis of starting strain and OE：：veA strains

3 結(jié)論

本研究以黑曲霉CICC 41702作為出發(fā)菌株，全局調(diào)控因子veA基因作為研究對象，通過分子手段構(gòu)建了過表達(dá)veA菌株OE：：veA。結(jié)果表明過表達(dá)veA基因會改變黑曲霉的菌落形態(tài)及菌絲形態(tài)。本課題組之前的研究以及Wang等的研究表明黑曲霉中的veA基因的缺失對菌絲形態(tài)也有一定程度影響[23，25]，可見veA基因?qū)谇咕z形態(tài)的發(fā)育至關(guān)重要。

Zhang等研究發(fā)現(xiàn)敲除黑曲霉中的veA基因，會消除赭曲霉毒素的積累[23]，而本研究表明過表達(dá)veA基因也會大幅度減少赭曲霉毒素的合成。因此veA基因既能正向又能負(fù)向調(diào)控赭曲霉毒素的產(chǎn)生，且推測veA對與OTA合成相關(guān)基因的調(diào)控作用在培養(yǎng)過程的后期更大。本研究為后續(xù)探究OTA生物合成途徑及防治黑曲霉中OTA的合成提供了理論依據(jù)。