申紅林，王鳳玲

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134）

灰樹花（Grifola frondosa）是一種中溫型、好氧、喜光真菌，富含多種對人體有重要保健作用的活性成分，而且多種營養(yǎng)素含量位于各類食用菌之首[1-2]?，F(xiàn)代研究表明，灰樹花多糖在抗病毒、免疫調(diào)節(jié)以及抵抗腫瘤等方面有顯著的生物學(xué)活性[3-4]，同時也起到調(diào)節(jié)血糖、血脂、血壓、治療肝炎、抗輻射、抗氧化等眾多作用[5-6]，因此對于灰樹花多糖的各項研究具有重要意義。

對于多糖的提取，普遍的提取方法是醇沉水提法，輔助方法有超聲[7]、微波[8]等。中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所和農(nóng)業(yè)部質(zhì)檢中心權(quán)威檢測可知，灰樹花干品中碳水化合物含量為21.4%。2018年季宏更等[9]比較灰樹花發(fā)酵液中提取多糖的水提法、輔助提取法（超聲輔助、微波輔助）和酶法提取，結(jié)果表明，水提法提取率為4.46%，輔助提取法中的微波輔助效果較好。有研究表明，在植物多糖提取過程中，添加纖維素酶、蛋白質(zhì)酶可以促進多糖的溶出，從而提高提取率[10-11]，但是存在單一酶使用量大、成本高等問題，從而復(fù)合酶的添加成為一種新的輔助提取方式。

本試驗以灰樹花干物質(zhì)為原料，響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合酶（纖維素酶和木瓜蛋白酶）聯(lián)合微波輔助提取灰樹花多糖工藝，選用sevage法去蛋白、001×7陰離子交換樹脂脫色和DEAE-52纖維素層析柱分離組分，并對初步分離純化出的兩種多糖GFP1、GFP2進行抗氧化性研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

灰樹花干物質(zhì)：河北省唐山市遷西縣；葡萄糖：北京盛世康普化工技術(shù)研究院；抗超氧陰離子自由基及產(chǎn)生超氧陰離子自由基測試盒、抗羥基自由基及產(chǎn)生羥基自由基測試盒、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）：南京建成生物工程研究所；木瓜蛋白酶（400 U/mg）：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；纖維素酶（3 U/mg）：國藥化學(xué)試劑有限公司；DEAE-52纖維素：Phygene公司；無水乙醇（分析純）：天津市光復(fù)精細化工研究所；氫氧化鈉（分析純）：天津海川化工有限公司；001×7大孔樹脂：河北源得爾節(jié)能科技有限公司。

微波催化合成/萃取儀（XH-100A）：祥鵠科技有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DK-8D）：上海森信實驗儀器有限公司；紫外分光光度儀（TU-1901）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 灰樹花多糖提取工藝

灰樹花干物質(zhì)→粉碎過80目篩→加入60℃純水→加入復(fù)合酶（木瓜蛋白酶、纖維素酶）→微波輔助提?。?0℃[12]）→滅酶（煮沸10 min）→冷卻離心取上清液→醇沉離心（5 000 r/min，10 min）→75%乙醇洗滌沉淀→復(fù)溶于水

1.2.2 灰樹花多糖純化工藝

1.2.1 得到的醇沉凍干得粗多糖→糖鏈的釋放（β-消除法[13]）→sevage法[14]去蛋白→001×7大孔樹脂脫色（將5 mg/mL的灰樹花多糖溶液以1 mL/min流速上樣，以蒸餾水洗脫，苯酚硫酸法跟蹤收集，直至流出液無多糖為止）→過DEAE-52纖維素柱，分別用0、0.05、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl溶液 1 mL/min 進行梯度洗脫，繪制洗脫曲線→選擇并合并洗脫效果佳的梯度醇沉，凍干得 GFP1、GFP2。

1.2.3 單因素試驗

以多糖提取量為指標(biāo)，在其他提取條件相同的情況下，考察不同微波功率、微波時間、料水比、酶配比（纖維素酶質(zhì)量∶木瓜蛋白酶質(zhì)量）、酶料比（復(fù)合酶質(zhì)量∶灰樹花干物質(zhì)質(zhì)量）5個因素[15-18]對灰樹花多糖提取量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)差異顯著大小選取微波時間（3、6、9 min）、料水比[1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40（g/mL）]、酶配比（2 ∶1、1 ∶1、1 ∶2）及酶料比（0.015、0.02、0.025 g/g）4 個因素，Box-Behnken法設(shè)計四因素三水平的試驗，得出灰樹花多糖提取的最優(yōu)工藝。

1.2.5 多糖提取量的測定

標(biāo)準曲線的制作：以干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準品配制濃度為 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL 一系列標(biāo)準溶液，采用苯酚硫酸法于489 nm波長處測定吸光度，繪制標(biāo)準曲線為：y=83.676x+0.026 3，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 0?；覙浠ǘ嗵翘崛×康挠嬎悖夯覙浠ǘ嗵翘崛×?（mg/g）=（ρ×V×n）/m。

式中：ρ為樣品中多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為溶劑體積，mL；m為灰樹花干物質(zhì)質(zhì)量，g；n為溶液稀釋倍數(shù)。

1.2.6 灰樹花多糖抗氧化性測定

將灰樹花多糖 GFP1、GFP2 配制成 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的水溶液，還原力測定方法按照文獻[19]測定。將灰樹花多糖GFP1、GFP2配制成 0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 mg/mL的水溶液，DPPH自由基清除率測定方法按照文獻[20]測定。將灰樹花多糖GFP1、GFP2配制成 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL 的水溶液，超氧陰離子自由基清除能力測定方法參考試劑盒說明書。將灰樹花多糖GFP1、GFP2配制成質(zhì)量濃度為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL的水溶液，羥基自由基清除能力測定方法參考試劑盒說明書。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用origin 2018進行整理和繪圖；利用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken法進行回歸模型方程的建立及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料水比對多糖提取量的影響

料水比對多糖提取量的影響見圖1。

圖1 料水比對多糖提取量的影響Fig.1 Effect of solid-water ratio on polysaccharide extraction

由圖1中可以看出，在料水比1∶10（g/mL）～1∶50（g/mL）的范圍內(nèi)，灰樹花多糖提取量呈現(xiàn)先增大后緩慢減少的趨勢。這種現(xiàn)象可能是因為水體積過小時，多糖在水中溶解不完全而且黏度過大造成的；水體積超過30倍時，多糖在大量溶劑中的傳遞效果和傳熱效果受到影響，從而使提取量變低。因此料水比1∶30（g/mL）為宜。

2.1.2 微波功率對多糖提取量的影響

微波功率對多糖提取量的影響見圖2。

圖2 微波功率對多糖提取量的影響Fig.2 Effect of microwave power on polysaccharide extraction

由圖2中可以看出，微波功率對多糖提取量的影響不顯著，在微波功率為300 W時，多糖提取量達到59.12 mg/g。因此選擇300 W作為響應(yīng)面優(yōu)化恒定條件。

2.1.3 微波時間對多糖提取量的影響

微波時間對多糖提取量的影響見圖3。

圖3 微波時間對多糖提取量的影響Fig.3 Effect of microwave time on polysaccharide extraction

由圖3中可以看出，當(dāng)微波時間過低時，多糖溶解不充分；當(dāng)微波時間大于6 min，大多數(shù)多糖物質(zhì)溶出，微波或復(fù)合酶對溶液中多糖開始降解，并對降解形成的還原糖進行進一步降解，導(dǎo)致脫水形成的糖醛衍生物含量降低，從而測定的多糖提取量降低。因此選擇微波時間6 min為宜。

2.1.4 酶料比對多糖提取量的影響

酶料比對多糖提取量的影響見圖4。

由圖4中可以看出，在酶料比在0.01 g/g～0.02 g/g的范圍內(nèi)，通過纖維素酶降解植物細胞壁纖維素骨架、木瓜蛋白酶降解細胞膜上脂蛋白的方式，提高多糖提取量。但當(dāng)酶料比大于0.02 g/g時，過量的酶不但無貢獻還會產(chǎn)生競爭性抑制反應(yīng)，導(dǎo)致多糖提取量降低。因此選擇酶料比0.02 g/g為宜。

2.1.5 酶配比對多糖提取量的影響

酶配比對多糖提取量的影響見圖5。

圖5 酶配比對多糖提取量的影響Fig.5 Effect of complex enzymes ratio on polysaccharide extraction

由圖5可知，復(fù)合酶的配比對多糖提取量的影響先升高后緩慢降低。不同的酶對多糖的提取效果不一樣，酶相互作用也會影響多糖提取量。纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比為1∶1時，酶相互作用最佳。因此選擇酶配比（纖維素酶質(zhì)量∶木瓜蛋白酶質(zhì)量）1∶1為宜。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝結(jié)果分析

2.2.1 試驗設(shè)計和結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇微波功率300 W作為響應(yīng)面優(yōu)化恒定條件，對微波時間、料水比、酶配比、酶料比4個因素進一步優(yōu)化。試驗方案與結(jié)果見表1。

2.2.2 擬合模型方程的建立與方差分析

以表1的試驗結(jié)果對其進行方差分析，結(jié)果見表2。

從表2可知，四因素擬合得到的二次多項式回歸方程：Y=74.44+5.21A-0.67B+2.04C-0.64D-1.96AB-7.94AC+1.42AD-5.39BC-1.78BD-5.70CD-7.06A2-2.92B2-7.47C2-15.93D2。

表1 Box-Behnken試驗方案與結(jié)果Table 1 Results of response surface experiments

表2 方差分析表Table 2 Variance analysis of regression model

該方程模型表現(xiàn)極顯著（p＜0.000 1），且失擬項不顯著（p＞0.05），說明所得到的方程擬合較好，回歸顯著，可用此回歸模型推測灰樹花多糖提取量并確定最優(yōu)工藝。根據(jù)回歸方程中各項系數(shù)的絕對值得到影響灰樹花多糖提取量的因素依次為：微波時間（A）＞酶料比（C）＞料水比（B）＞酶配比（D）。

2.2.3 響應(yīng)面圖分析

4個因素交互作用的響應(yīng)面圖如圖6所示。

圖6 不同提取條件對灰樹花多糖提取量影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagram of the effects of different extraction conditions on the extraction of polysaccharide from grifola frondosa

由圖6可看出，酶配比和時間、酶料比和時間、酶料比和酶配比的交互作用對多糖提取量的影響顯著，表現(xiàn)為響應(yīng)面坡度較大。酶料比和料水比的交互作用對多糖提取量的影響次之。料水比和時間、酶配比和料水比的交互作用對多糖提取量的影響不顯著，表現(xiàn)為響應(yīng)面圖坡度趨于平緩。

經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化得到灰樹花多糖最佳提取工藝為微波時間 7.19 min、料水比 1 ∶27.31（g/mL）、酶配比 1 ∶1（質(zhì)量比）、酶料比0.02 g/g。為試驗操作方便，將灰樹花多糖提取最優(yōu)條件修正為微波時間7 min、料水比 1∶27（g/mL）、酶配比 1 ∶1（質(zhì)量比）、酶料比0.02 g/g，此條件下，3次提取平均提取量為73.25 mg/g，與理論值的相對誤差為3.17%。由此可知，響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合酶協(xié)同微波輔助提取灰樹花多糖是合理可行的。本方法提取量相較顧華杰等[19]研究的水提法、超聲輔助法、微波輔助法提取率分別高64%、50%、48%。

2.3 DEAE-52纖維素層析柱洗脫曲線

DEAE-52纖維素層析柱洗脫曲線見圖7。

圖7 多糖DEAE-52纖維素層析柱洗脫曲線Fig.7 Elution curve of polysaccharide DEAE-52 cellulose column

由圖7可篩選出采用去離子水和0.5 mol/L NaCl溶液洗脫得到的灰樹花多糖GFP1和GFP2，其分離效果好，兩組分分離較開，且分離圖形較對稱，說明DEAE-52纖維素層析柱分離這兩組分得到較滿意的效果。

2.4 灰樹花多糖抗氧化性測定

GFP1和GFP2的還原力和清除DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的能力見圖8～圖11。

圖8 GFP1和GFP2的還原力Fig.8 Reducing power of GFP1 and GFP2

圖9 GFP1和GFP2對DPPH自由基的清除能力Fig.9 Scavenging ability of GFP1 and GFP2 to DPPH free radicals

圖10 GFP1和GFP2對羥基自由基的清除能力Fig.10 Scavenging ability of GFP1 and GFP2 for hydroxyl radicals

圖11 GFP1和GFP2對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.11 Scavenging ability of GFP1 and GFP2 for superoxide anion

由圖8～圖11可知，多糖濃度為6 mg/mL時，GFP1和GFP2在700 nm處的OD值達到0.43和0.48，優(yōu)于同質(zhì)量濃度下的茯苓多糖OD值（0.283）[21]，并且GFP2的還原力優(yōu)于GFP1。濃度為2mg/mL時，GFP2的DPPH自由基清除率達到50%，優(yōu)于GFP1。濃度為6 mg/mL時，GFP1和GFP2的羥基自由基清除率超過65%，而且提取物濃度大于5 mg/mL時，GFP2的羥基自由基清除率大于GFP1。濃度為5 mg/mL時，GFP1和GFP2的超氧陰離子自由基清除率都達到了80%。綜上所述，GFP1和GFP2在體外表現(xiàn)出良好的抗氧化性，且GFP2的抗氧化效果更好，在濃度大于5 mg/mL下各指標(biāo)抗氧化效果與VC相差不大。

3 結(jié)論

本研究采用復(fù)合酶結(jié)合微波輔助提取灰樹花多糖，響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳提取工藝為，微波時間7 min、料水比 1∶27（g/mL）、酶配比 1 ∶1（質(zhì)量比）、酶料比0.02（g/g），此條件下，提取得到的灰樹花多糖實際提取量為73.25mg/g，與理論值偏差較小。該方法高效、簡單、提取率高，可用作灰樹花多糖的提取工藝。提取得到的粗多糖經(jīng)sevage法去蛋白、001×7樹脂脫色和DEAE-52纖維素層析柱分離得到GFP1和GFP2，其抗氧化試驗結(jié)果表明，GFP1和GFP2還原力較強，對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除效果良好。GFP2抗氧化性優(yōu)于GFP1，且在一定濃度下，GFP2抗氧化效果與VC相當(dāng)。因此灰樹花多糖經(jīng)一系列純化技術(shù)后，可以成為一種天然健康的抗氧化劑。