艾丹,常若葵,張斌,于瑋瑋,王遠(yuǎn)宏,*
(1.天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院,天津300384;2.天津農(nóng)學(xué)院工程技術(shù)學(xué)院,天津300384)
近年來(lái),隨著生活水平的提高,人們對(duì)水果的需求與日俱增,水果采后腐爛問(wèn)題也變得愈發(fā)凸顯,而通過(guò)微生物控制水果采后病害作為化學(xué)保鮮劑的良好替代品,已成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)和發(fā)展趨勢(shì),且與傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥相比,生物防治具有良好的環(huán)境相容性和生物安全性[1]。其中,酵母菌因其遺傳穩(wěn)定、抑菌譜廣、對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件要求低、生長(zhǎng)迅速、能夠在水果表面定殖等諸多優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注[2-3]。
本研究中的美極梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)是從藍(lán)莓果實(shí)上分離篩選出的酵母菌種,該酵母菌不僅可以對(duì)水果采后灰霉菌和鏈格孢菌有較強(qiáng)的抑制作用,還可以有效抑制青霉和芽枝霉菌,是一株具有開(kāi)發(fā)潛力的采后生防酵母菌,鑒于生防酵母菌作為活體生物殺菌劑,對(duì)水果采后病原菌的抑制往往建立在菌株安全的基礎(chǔ)上,因此其安全性是影響公眾接受度的最主要因素[4]。因此,對(duì)生防菌的安全性進(jìn)行評(píng)估,特別是就生防菌株本身及其代謝產(chǎn)物對(duì)動(dòng)物和人體的毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)尤為必要[5-8]。而目前針對(duì)該酵母菌安全性的研究還未見(jiàn)報(bào)道,本文以昆明種鼠為實(shí)驗(yàn)材料,參照GB 15193.1-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序》[9],測(cè)定了不同劑量美極梅奇酵母菌T-2發(fā)酵液對(duì)大鼠的急性經(jīng)口毒性、遺傳毒性試驗(yàn)及30 d經(jīng)口毒性的影響,對(duì)其進(jìn)行安全性評(píng)價(jià),為今后新資源的開(kāi)發(fā)和商業(yè)化實(shí)踐生產(chǎn)提供科學(xué)的理論依據(jù)。
菌株:酵母菌T-2由天津農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室從藍(lán)莓果實(shí)分離并保存,經(jīng)初步鑒定為梅奇酵母屬(Metschnikowia sp.)。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:清潔級(jí)昆明種小鼠,雌雄各半,年齡在3~4個(gè)月之間,體重18 g~20 g;清潔級(jí)成年大鼠,雌雄各半,體重180 g~220 g。供試鼠及飼料均購(gòu)于中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)室溫度20℃~25℃,自由攝食和飲水[10]。鼠籠墊料及飲水壺每2 d更換并進(jìn)行清洗,以保持清潔。
AMES試劑盒:北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司;環(huán)磷酰胺:上海源葉生物科技有限公司;吉姆薩染液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered salin,PBS)、蘇木素、伊紅:Solarbio公司;品紅、酒精、甲醇、甲醛、二甲苯:分析純,天津風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司;分化液、返藍(lán)液:廣州市凱秀貿(mào)易有限公司。
AX224ZH/E型電子天平:奧豪斯儀器(常州)公司;shinva高壓滅菌鍋:山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司;DPX-9052B-2型電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海?,攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SHP-250A型生化培養(yǎng)箱:上海培因?qū)嶒?yàn)儀器有限公司;Sigma3-16PK臺(tái)式高速冷凍離心機(jī):德國(guó)希格瑪離心機(jī)公司;HI 1220烘片機(jī)、HI 1210展片機(jī)、RM2235切片機(jī)萊卡:德國(guó)徠卡公司;Microlab 300生化儀:合普機(jī)電工程(天津)有限公司;TEK-Ⅱ全自動(dòng)三分群血細(xì)胞分析儀:江西特康科技有限公司。
挑取在YPD平板上新鮮培養(yǎng)的T-2單菌落,接入到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中,于28℃、200 r/min下?lián)u培發(fā)酵48 h,菌體濃度約為1×1011cfu/mL,于12 000 r/min下冷凍離心2 min,使菌體沉淀,棄上清液,留菌體,加入0.5 mL YPD液體培養(yǎng)基,振蕩混勻后備用;同時(shí),將發(fā)酵液分別濃縮為10倍液(50 mg/L)、50倍原液(250 mg/L)、100倍原液(500 mg/L)和 400倍原液(2 000 mg/L),備用。
參照GB15193.3-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)》[11],實(shí)驗(yàn)按照限量法[11],取 20 只 180 g~220 g的清潔級(jí)昆明大鼠(n=10),雌雄各半,適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d~3 d。隨機(jī)分組標(biāo)號(hào),禁食16 h后,設(shè)T-2菌體為10 g/kg劑量,按大鼠最大耐受容積(1 mL/只)對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃處理,以生理鹽水為對(duì)照組,連續(xù)2次灌胃,間隔4h,觀察14d,記錄小鼠中毒癥狀和死亡時(shí)間[12-13]。
1.5.1 Ames實(shí)驗(yàn)
選取經(jīng)鑒定符合實(shí)驗(yàn)要求的4株鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株TA97、TA98、TA100和TA102進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以大鼠肝S-9混合液作為代謝活化系統(tǒng),按AMES試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作,受試物為滅活的酵母菌,實(shí)驗(yàn)分別設(shè)4個(gè)劑量組,各劑量組酵母菌濃度分別為 5×1010、1×1010、2×109、4×108CFU/皿,相當(dāng)于 5、1、0.2、0.04 mg/皿。采用平板摻入法,每個(gè)菌株每個(gè)測(cè)試劑量均做3個(gè)平行皿,37℃下培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)每皿回變菌落數(shù)。
1.5.2 精子畸變實(shí)驗(yàn)
取25只清潔級(jí)昆明成年雄鼠(n=5),適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d~3 d。隨機(jī)分組標(biāo)號(hào),用T-2菌株的100倍原液(500 mg/L)、10倍原液(50 mg/L)、原液(5 mg/L)對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃處理(0.1 mL/只),陽(yáng)性對(duì)照組灌胃環(huán)磷酰胺40 mg/(kgbw·d),陰性對(duì)照組為生理鹽水組,連續(xù)5 d灌胃,末次灌胃后的第30天斷頸處死;取其雙側(cè)附睪,撕開(kāi)包膜,用吸管反復(fù)吸打多次,懸液制片,伊紅染色。每只小鼠觀察1 000個(gè)完整精子,記錄各類畸形精子數(shù),計(jì)算精子畸變率(%)[14]。
1.5.3 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)
取50只18g~20g的清潔級(jí)昆明小鼠(n=10),雌雄各半,適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d~3 d。隨機(jī)分組標(biāo)號(hào),用T-2菌株的100倍原液(500mg/L)、1/4的100倍原液(125mg/L)、1/16的100倍原液(31.25 mg/L)對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃處理(0.1mL/只),陽(yáng)性對(duì)照組灌胃環(huán)磷酰胺40mg/(kgbw·d),陰性對(duì)照組為生理鹽水組,連續(xù)2次灌胃,間隔24 h,末次灌胃6 h~12 h后,小鼠斷頸處死,取股骨骨髓溶于小牛血清,涂片后甲醇固定,染色制片,油鏡觀察1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(polychromaticerythrocytes,PCE)及PCE微核發(fā)生率[15]。
取56只18 g~20 g的清潔級(jí)昆明小鼠(n=14),雌雄各半,適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d~3 d。隨機(jī)分組標(biāo)號(hào),用酵母菌的 100倍原液(500 mg/L)、50倍原液(250 mg/L)、10倍原液(50 mg/L)對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃處理(0.1 mL/只),對(duì)照組灌胃等體積的生理鹽水組,連續(xù)30 d灌胃,觀察小鼠的活動(dòng)和生長(zhǎng)情況,每日記錄其飲水量、攝食量,每2 d稱體重1次,計(jì)算其食物利用率。30 d后眼球取血,測(cè)血液學(xué)和血液生化指標(biāo),處死后摘除指定內(nèi)臟測(cè)其臟器指數(shù),將各臟器用10%中性甲醛溶液固定,進(jìn)行常規(guī)病理取材、制片和HE染色(蘇木精-伊紅染色法,hematoxylin-eosinstaining),顯微鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)檢查[16]。
統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,以P<0.05和P<0.01為差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
在觀察期間內(nèi),灌胃T-2菌株的大鼠均未出現(xiàn)不良反應(yīng),72 h內(nèi)各處理組未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,且各處理組的進(jìn)食、飲水以及各種生命活動(dòng)與對(duì)照相比均無(wú)明顯異常;經(jīng)連續(xù)飼養(yǎng)觀察14 d,所有實(shí)驗(yàn)鼠生命表現(xiàn)依然正常。未見(jiàn)驚厥、被毛粗亂、行動(dòng)異常等異常表現(xiàn),生長(zhǎng)情況良好,無(wú)死亡發(fā)生。結(jié)果表明,菌株T-2對(duì)大鼠的急性經(jīng)口半致死劑量(LD50)>10 g/kg。表明T-2菌株的急性經(jīng)口毒性為“無(wú)毒”級(jí)[11]。
2.2.1 Ames實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。
加與不加S9的代謝活化系統(tǒng),其自發(fā)回變組、溶劑對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組均在正常范圍,受試樣品各劑量組回變菌落數(shù)均未見(jiàn)明顯增加,未超過(guò)自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍及以上,亦無(wú)劑量-反應(yīng)關(guān)系(重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果具有很好的重現(xiàn)性)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在本實(shí)驗(yàn)條件下,該酵母菌在Ames實(shí)驗(yàn)中無(wú)致突變性。
表1 Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=3)Table 1 The results in Ames test(±s,n=3)
表1 Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=3)Table 1 The results in Ames test(±s,n=3)
注:**P<0.01,與溶劑對(duì)照組比較有極顯著差異。
組別/(mg/皿)TA97 TA98 TA100 TA102-S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 5 231.0±19.5 196.6±20.9 87.7±9.0 61.2±7.5 163.3±16.9 236.1±17.7 210.3±18.9 231.3±20.9 1 128.8±13.3 102.5±10.9 37.0±4.7 35.7±5.9 91.2±11.0 86.5±9.3 215.7±16.7 206.1±21.7 0.2 146.4±12.8 74.3±11.8 79.3±8.8 52.3±6.0 52.7±6.7 65.2±9.1 208.3±21.3 232.6±19.0 0.04 67.1±7.5 83.0±10.4 44.1±6.3 31.3±5.0 24.0±4.9 39.2±5.5 196.4±22.2 181.2±18.4自發(fā) 111.3±15.5 89.5±11.6 34.2±5.3 26.4±6.8 112.2±11.9 190.1±19.7 188.6±19.1 243.2±20.6溶劑 122.5±21.6 107.1±22.3 32.7±7.9 43.1±6.1 99.1±10.1 138.0±12.3 116.1±19.9 116.5±23.0陽(yáng)性 2 612.0±322.8**1 964.1±363.1**2 557.4±119.9**1 822.0±212.2**1 583.6±259.2**1 187.2±199.1**1 757.9±240.9**1 831.3±319.8**
2.2.2 精子畸變實(shí)驗(yàn)
酵母菌株T-2對(duì)小鼠精子畸形率的影響如表2所示。
陽(yáng)性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺)小鼠精子畸形率為0.15%,畸變發(fā)生率極顯著高于灌胃酵母菌的各劑量組及陰性對(duì)照組(生理鹽水)(P<0.01),而酵母菌T-2各劑量組小鼠精子畸形率未出現(xiàn)明顯增加,與陰性對(duì)照組(生理鹽水)比較,無(wú)顯著性差異(P>0.05)。說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi),菌株T-2對(duì)小鼠精子無(wú)致畸作用。
表2 小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=3)Table 2 Effect of T-2 on sperm abnormality rate in mice(±s,n=3)
表2 小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=3)Table 2 Effect of T-2 on sperm abnormality rate in mice(±s,n=3)
注:**P<0.01,與生理鹽水(陰性)對(duì)照組比較有極顯著差異。
組別 動(dòng)物數(shù) 觀察精子數(shù) 畸形精子數(shù) 畸形率/%環(huán)磷酰胺 5 5×1 000 742 0.15**生理鹽水 5 5×1 000 137 0.03 500 mg/L 5 5×1 000 157 0.03 50 mg/L 5 5×1 000 144 0.03 5 mg/L 5 5×1 000 140 0.03
2.2.3 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)
菌株T-2對(duì)小鼠骨髓PCE微核實(shí)驗(yàn)的影響如表3所示。
表3 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=3)Table 3 Effect of T-2 on microkernel rate of polychromatic erythrocytes in mice(±s,n=3)
表3 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=3)Table 3 Effect of T-2 on microkernel rate of polychromatic erythrocytes in mice(±s,n=3)
注:**P<0.01,與生理鹽水(陰性)對(duì)照組比較有極顯著差異。
組別 動(dòng)物數(shù) PCE個(gè)數(shù) 微核數(shù) 微核率/%雌鼠生理鹽水組 5 5×1 000 4 1.0±0.7雌 500 mg/L 5 5×1 000 7 1.4±0.5雌 125 mg/L 5 5×1 000 7 1.4±0.9雌 31.25 mg/L 5 5×1 000 7 1.4±0.5雌環(huán)磷酰胺組 5 5×1 000 63 12.6±2.1**雄鼠生理鹽水組 5 5×1 000 5 1.0±0.7雄 500 mg/L 5 5×1 000 8 1.6±0.5雄 125 mg/L 5 5×1 000 7 1.4±0.5雄 31.25 mg/L 5 5×1 000 6 1.2±0.4雄環(huán)磷酰胺組 5 5×1 000 89 17.8±2.4**
與小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似,環(huán)磷酰胺組即陽(yáng)性對(duì)照組小鼠骨髓細(xì)胞的微核率極顯著高于生理鹽水組即陰性對(duì)照組微核率和菌株T-2各劑量組微核率(P<0.01)。各酵母菌劑量組小鼠骨髓細(xì)胞的微核率與陰性對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi),菌株T-2不會(huì)對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核造成顯著影響,即菌株T-2的小鼠骨髓嗜微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。
小鼠生產(chǎn)性能實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4,小鼠血常規(guī)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5,小鼠血生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。
由表4可知,灌胃菌株T-2的高(500 mg/L)、中(250 mg/L)、低(50 mg/L)各劑量組雌鼠和雄鼠的生產(chǎn)性能(即體質(zhì)量與攝食量)數(shù)據(jù)雖都有所增加,但變化幅度較小,未見(jiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系,且與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。說(shuō)明菌株T-2對(duì)小鼠的生產(chǎn)性能(即體質(zhì)量與攝食量)無(wú)明顯影響。由表5、表6可知,灌胃菌株T-2高、中、低各劑量組小鼠的血常規(guī)指標(biāo)和血液生化指標(biāo)與對(duì)照組均無(wú)顯著差異(P>0.05)。說(shuō)明菌株T-2對(duì)小鼠的血液常規(guī)指標(biāo)沒(méi)有影響。灌胃菌株T-2各實(shí)驗(yàn)組小鼠心、肝、脾、肺、腎臟器指數(shù)與對(duì)照組均無(wú)顯著差異(P>0.05),結(jié)果見(jiàn)表7。說(shuō)明該菌株對(duì)小鼠的臟器指數(shù)沒(méi)有影響。
表4 小鼠生產(chǎn)性能實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=3)Table 4 Effect of T-2 on performance in mice(±s,n=3)
表4 小鼠生產(chǎn)性能實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=3)Table 4 Effect of T-2 on performance in mice(±s,n=3)
注:P>0.05,與對(duì)照組比較,各處理組小鼠體重及攝食量指標(biāo)無(wú)顯著性差異。
組別 只數(shù) 初重/g 末重/g 增重/g 攝食量/g 料重比雌 對(duì)照組 7 21.03±1.02 32.35±3.08 11.32±2.51 122.85 10.86±2.34雌 50 mg/L 7 22.28±1.67 31.51±1.51 9.23±1.08 133.31 14.45±1.73雌 250 mg/L 7 23.69±2.42 33.08±2.88 9.39±1.01 121.05 12.89±1.35雌 500 mg/L 7 22.92±2.11 31.14±0.27 8.23±2.00 115.31 14.02±3.65雄 對(duì)照組 7 24.97±0.65 38.58±2.62 13.61±2.41 139.83 10.28±1.84雄 50 mg/L 7 25.16±0.67 38.19±2.34 13.03±2.66 138.58 10.64±2.99雄 250 mg/L 7 24.55±1.48 36.80±3.66 12.26±2.87 125.82 10.27±3.87雄 500 mg/L 7 24.29±1.22 36.87±2.17 12.58±1.18 134.59 10.70±1.02
表5 小鼠血常規(guī)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=3)Table 5 Effect of T-2 on blood routine index in mice(±s,n=3)
表5 小鼠血常規(guī)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=3)Table 5 Effect of T-2 on blood routine index in mice(±s,n=3)
注:P>0.05,與對(duì)照組比較,各處理組小鼠血常規(guī)指標(biāo)無(wú)顯著性差異。
組別紅細(xì)胞/(1012/L)白細(xì)胞/(109/L)血紅蛋白/(g/L)血小板/(109/L)中性細(xì)胞數(shù)/(109/L)對(duì)照組 10.74±1.02 2.44±0.63 158.50±22.01 588.00±534.73 0.65±0.26 50 mg/L 10.23±0.39 4.15±2.53 161.86±5.08 505.14±193.40 0.83±0.31 250 mg/L 10.76±0.56 3.85±1.20 164.17±6.18 777.70±405.48 0.96±0.29 500 mg/L 10.21±0.61 2.71±0.47 162.60±7.23 684.64±450.07 0.54±0.13組別淋巴細(xì)胞數(shù)/(109/L)單核細(xì)胞/(109/L)中性細(xì)胞比率/%淋巴細(xì)胞比率/%單核細(xì)胞比率/%對(duì)照組 1.59±0.54 0.08±0.05 27.10±10.05 64.13±13.11 2.90±1.57 50 mg/L 2.91±1.92 0.15±0.13 20.77±7.98 68.05±4.83 3.13±1.59 250 mg/L 2.58±0.95 0.04±0.02 29.73±9.90 65.93±8.10 1.13±0.39 500 mg/L 1.78±0.45 0.07±0.03 19.80±2.53 65.00±6.83 2.68±1.44
表6 小鼠血生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=3)Table 6 Effect of T-2 on blood biochemistry indexes in mice(±s,n=3)
表6 小鼠血生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=3)Table 6 Effect of T-2 on blood biochemistry indexes in mice(±s,n=3)
注:P>0.05,與對(duì)照組比較,各處理組小鼠血清生化指標(biāo)無(wú)顯著性差異。
白蛋白/(g/L)對(duì)照組 61.52±9.22 124.73±41.00 2.51±1.26 34.11±0.87 50 mg/L 70.61±9.67 168.03±58.50 2.09±0.18 34.23±1.01 250 mg/L 72.44±11.89 180.85±50.21 2.31±0.56 37.77±5.48 500 mg/L 74.38±13.16 153.43±38.32 2.11±0.15 35.12±3.60組別 谷丙轉(zhuǎn)氨酶/(U/L)谷草轉(zhuǎn)氨酶/(U/L)甘油三酯/(mmol/L)總蛋白/(g/L)58.64±1.32 58.60±2.11 59.69±4.69 57.70±1.57總膽固醇/(mmol/L)血糖/(mmol/L)4.46±0.90 20.83±3.53 47.41±18.00 6.00±1.79 3.78±0.89 19.16±2.67 37.02±19.14 6.30±1.23 4.43±0.48 18.83±4.07 29.61±22.00 7.12±2.49 3.85±0.59 18.62±3.80 36.52±10.52 7.00±1.54血尿素氮/(mg/dL)肌酐/(μmol/L)
菌株T-2對(duì)小鼠臟器病理組織學(xué)的影響見(jiàn)圖1,實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠各器官剖檢均未見(jiàn)明顯病理變化, 即對(duì)臟器組織沒(méi)有損傷。
表7 臟器指數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=3)Table 7 Effect of T-2 on organ index in mice(±s,n=3)
表7 臟器指數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=3)Table 7 Effect of T-2 on organ index in mice(±s,n=3)
注:P>0.05,與對(duì)照組比較,各處理組小鼠臟器指數(shù)無(wú)顯著性差異。
組別 只數(shù) 心/% 肝/% 脾/% 肺/% 腎/%對(duì)照組 8 0.57±0.07 3.83±0.53 0.28±0.04 0.61±0.14 1.03±0.25 50 mg/L 8 0.50±0.06 3.78±0.34 0.31±0.06 0.65±0.15 1.01±0.23 250 mg/L 8 0.56±0.10 3.77±0.46 0.30±0.06 0.64±0.09 1.07±0.24 500 mg/L 8 0.56±0.12 3.89±0.46 0.23±0.07 0.52±0.08 0.93±0.14
圖1 菌株T-2對(duì)小鼠臟器病理組織學(xué)的影響(HE×400)Fig.1 Effect of T-2 on visceral organ changes in rats(HE×400)
許多研究表明酵母菌是一種理想的生防制劑[17],因?yàn)樗哂心軌蚋缴谥参锷厦?,?duì)植物和人類沒(méi)有致病性且能迅速增殖、遺傳穩(wěn)定、有較強(qiáng)抗逆性等優(yōu)點(diǎn),更容易被人們所廣泛接受[18]。而美極梅奇酵母菌T-2作為一株具有采后生防潛力的酵母菌株,將其制成生防制劑,保證菌體本身及其所產(chǎn)活性代謝產(chǎn)物對(duì)動(dòng)物的安全性是最基本的要求之一[19]。本研究采用清潔級(jí)鼠,用美極梅奇酵母菌T-2對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃處理,參照GB 15193.1-2014[9]進(jìn)行了致突變性評(píng)價(jià),可進(jìn)一步探明生防菌對(duì)動(dòng)物體正常生理代謝的影響[20],為酵母菌作為采后保鮮生防制劑的食用安全性提供一定的科學(xué)依據(jù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,菌株T-2對(duì)大鼠的急性經(jīng)口毒性屬于“無(wú)毒”級(jí)(LD50>10 g/kg)[11]。酵母菌 T-2 在 Ames實(shí)驗(yàn)中未呈現(xiàn)致突變性。在小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)中,50 mg/L~500 mg/L實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi),小鼠各劑量組與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05);骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)是一種用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)染色體損傷的化學(xué)毒物的實(shí)驗(yàn)方法[21],在31.25 mg/L~500 mg/L的實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi),小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。血液學(xué)指標(biāo)反映機(jī)體內(nèi)環(huán)境及造血功能的變化,血清生化指標(biāo)檢驗(yàn)機(jī)體生理成分、代謝情況及重要器官的功能狀態(tài),其中腎功能及肝功能的變化是考察藥物是否存在蓄積毒性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示酵母菌T-2在50、250、500 mg/L各劑量組血液學(xué)與血清生化結(jié)果均在正常參考值范圍內(nèi),與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。病理組織學(xué)檢查也未見(jiàn)明顯肝臟功能性損傷,臟器指數(shù)也無(wú)顯著性差異,說(shuō)明酵母菌T-2不會(huì)對(duì)小鼠臟器造成損害。
綜上所述,可以推斷出在嚴(yán)格控制使用劑量和使用方法的情況下,美極梅奇酵母T-2對(duì)人體不會(huì)產(chǎn)生不良遺傳毒性影響。因此在商業(yè)化貯藏保鮮果品中使用該生防菌劑防治病害是比較安全的,具有進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)的價(jià)值。