賈鴻儒 任俞新 牛曉鈺

摘要：以長(zhǎng)春花幼嫩頂芽與莖段為外植體，研究了不同滅菌劑及處理時(shí)間對(duì)外植體的滅菌效果及外植體材料對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，長(zhǎng)春花頂芽為外植體，用75%酒精滅菌30 s+0.1%升汞滅菌300 s效果較好，此條件下外植體污染率為5.5%、褐變率為9.3%。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS+3.0 mg/L 6-BA +2.0 mg/L 2，4-D效果較好，誘導(dǎo)率可達(dá)86.6%。以長(zhǎng)春花頂芽為外植體時(shí)產(chǎn)生愈傷組織的時(shí)間較旱，出愈率為92.6%，愈傷組織團(tuán)塊大、致密，表面有小疣突，預(yù)期有較好的不定芽分化能力。

關(guān)鍵詞：長(zhǎng)春花;外植體滅菌;愈傷組織誘導(dǎo);研究

中圖分類(lèi)號(hào)：S567.23? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? 文章編號(hào)：1001-1463（2020）10-0051-03

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2020.10.011

Abstract：In this paper，the young top buds and stem segments of Catharanthus roseus were used as explants to study the effects of different sterilization agents and treatment time on the sterilization of explants and the effects of different explants on callus induction. The results showed that the top bud of periwinkle was explants， the sterilization effect was better with 75% alcohol for 30 s and 0.1% mercury for 300 s， the contamination rate of the explants was 5.5% and the browning rate was 9.3%. Callus induction medium with MS+3.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2， 4-d had a good effect， with an induction rate of 86.6%. The callus was produced in a relatively short time and the rate of callus was 92.6% when the terminal bud was used as explants. The callus was large and dense， with small wart on the surface， and the adventitious bud differentiation ability was expected to be good.

Key words：Catharanthus roseus;Explant sterilization;Callus induction;Study

長(zhǎng)春花[Catharanthus roseus （L.）G. Don]為夾竹桃科長(zhǎng)春花屬觀賞及藥用植物，亞灌木、高達(dá)60 cm，花色艷麗，花朵繁多。長(zhǎng)春花性喜高溫、高濕，耐半陰，不耐嚴(yán)寒，最適宜溫度為20～33 ℃，喜陽(yáng)光，忌濕怕澇，一般土壤均可栽培，但鹽堿土壤不宜，以排水良好、通風(fēng)透氣的砂質(zhì)或富含腐殖質(zhì)的土壤為好，花期、果期幾乎全年。長(zhǎng)春花原產(chǎn)地中海沿岸、印度、熱帶美洲，是園林綠化的良好材料，中國(guó)各地引進(jìn)不少新品種，可用于盆栽、花壇種植及栽植槽觀賞[1 ]。長(zhǎng)春花作為中草藥可全草入藥，具有止痛消炎、安眠、通便及利尿等作用，還可用于清洗傷口、治療壞血病等[2 - 4 ]。但長(zhǎng)春花種子細(xì)小，結(jié)實(shí)量不高，出苗率較低，扦插繁殖繁殖系數(shù)也不高，利用組織培養(yǎng)快速繁殖無(wú)菌苗是長(zhǎng)春花苗木生產(chǎn)的重要途徑。我們以長(zhǎng)春花幼嫩的頂芽、莖段為外植體材料，進(jìn)行愈傷組織的培養(yǎng)及快速繁殖試驗(yàn)。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試材料

試驗(yàn)材料采自甘肅林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院校內(nèi)實(shí)訓(xùn)基地。選取長(zhǎng)春花幼嫩新枝，用清水沖洗干凈后備用。

1.2? ?試驗(yàn)方法

1.2.1? ? 外植體的制備? ? 將從樣品植株上剪取的幼嫩新枝用自來(lái)水沖洗干凈，蒸餾水漂洗3～4次，在無(wú)菌條件下剪成2～3 cm的小段，放入廣口瓶中。先倒入75%酒精，搖動(dòng)30 s后用無(wú)菌水沖洗3～5次，分別加入0.1%升汞溶液滅菌（180、300、420 s）、飽和漂白粉上浸液滅菌（300、600、900 s），用無(wú)菌水沖洗5～6次[5 ]，將材料放入鋪有無(wú)菌濾紙的接種盤(pán)中備用。

將消毒滅菌所得材料切去兩頭褐化部分，剩余部分切割成0.5～1.0 cm外植體，接種到MS+500 mg/L LH基本培養(yǎng)基上，共設(shè)6個(gè)處理（試驗(yàn)方案見(jiàn)表1），每處理10瓶，每瓶接種外植體1塊，3次重復(fù)。接種14 d后檢查污染率與褐變率。

污染率=（污染的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%。

褐變率=（褐變的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%。

1.2.2? ? 培養(yǎng)條件? ? 培養(yǎng)基中加入3%的蔗糖、6 g/L 瓊脂，pH 5.6[6 ]。培養(yǎng)室溫度為（22±2） ℃， 無(wú)菌材料在暗光下培養(yǎng)15 d后轉(zhuǎn)入光周期12 h/12 h（光/暗）的條件下培養(yǎng)。光照強(qiáng)度約30 μmol/（m2·s） [7 ]。

1.2.3? ? 愈傷組織培養(yǎng)? ? 將初試培養(yǎng)所得無(wú)菌材料分頂芽和莖段2組，分別接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。愈傷組織誘導(dǎo)以MS為基本培養(yǎng)基，采用6-BA、2，4-D的2因素3水平隨機(jī)設(shè)計(jì)，共9個(gè)處理（表2），每處理10瓶（頂芽和莖段各5瓶），每瓶接種1個(gè)外植體，重復(fù)3次。弱光下培養(yǎng)40 d后觀察統(tǒng)計(jì)出愈率。

出愈率=（出愈數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?滅菌劑及處理時(shí)間對(duì)外植體滅菌效果的影響

通過(guò)表1可以看出，75%酒精+0.1%升汞滅菌處理的污染率均明顯低于75%酒精+飽和漂白粉上浸液滅菌處理，但褐變率卻明顯高于后者。分析認(rèn)為，75%酒精滅菌30 s+0.1%升汞滅菌300 s是長(zhǎng)春花細(xì)嫩莖段及頂芽外植體較理想的消毒組合。

2.2? ?不同激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

觀察發(fā)現(xiàn)，滅菌所得材料轉(zhuǎn)接到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，7 d后頂芽及莖切段肥大，下端切口處有膨大的愈傷現(xiàn)象，40 d后各處理愈傷組織塊明顯增大，但不勻一，部分愈傷塊較致密、且表面有小疣突（圖1）。從表2可以看出，6-BA、2，4-D對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的出愈率以6-BA濃度為3.0 mg/L、2，4-D濃度為2.0 mg/L時(shí)最大，為86.6%;6-BA、2，4-D濃度分別大于3.0、2.0 mg/L時(shí)，愈傷組織松散透明，失去了不定芽分化的能力。分析認(rèn)為，MS+2.0 mg/L 2，4-D+3.0 mg/L 6-BA是較為理想的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，此條件下誘導(dǎo)率為86.6%，愈傷組織塊大、致密，表面有小疣突，有較好的不定芽分化能力。

2.3? ?不同外植體材料對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

分別用幼嫩的頂芽和莖段作為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)[8 ]，結(jié)果（表3）表明，2種外植體均能產(chǎn)生愈傷組織，但愈傷組織出現(xiàn)的時(shí)間不同。其中以頂芽為外植體的出愈時(shí)間較快，一般接種后6～7 d內(nèi)可見(jiàn)愈傷，以莖段為外植體則需要14～20 d可見(jiàn)愈傷。2種外植體的出愈率也有明顯的差異，接種40 d后觀察，頂芽的愈傷組織誘導(dǎo)率較高，為92.6%;莖段相對(duì)較低，為 76.3%，愈傷組織形態(tài)也有明顯差異。頂芽外植體產(chǎn)生的愈傷組織淡綠、有明顯疣突，預(yù)期不定芽分化效果較好。

3? ?小結(jié)與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，用75%酒精滅菌30 s、無(wú)菌水沖洗干凈后再轉(zhuǎn)入0.1 %升汞溶液中滅菌300 s是長(zhǎng)春花細(xì)嫩莖段及頂芽外植體較理想的消毒組合，處理后的外植體污染率為5.5%、褐變率為9.3%。 MS+3.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2，4-D是長(zhǎng)春花愈傷組織誘導(dǎo)最適宜的培養(yǎng)基組合，出愈率高達(dá)86.6%，以長(zhǎng)春花頂芽為外植體產(chǎn)生愈傷組織的時(shí)間較早，出愈率為92.6%，愈傷組織團(tuán)塊大、致密，表面有小疣突，預(yù)期有較好的不定芽分化能力。

愈傷組織的誘導(dǎo)主要受外植體本身、培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件3方面因素的影響。外植體的選擇和消毒是組織培養(yǎng)順利進(jìn)行的前提，植物愈傷組織誘導(dǎo)是細(xì)胞脫分化的過(guò)程，也是產(chǎn)生大量細(xì)胞團(tuán)，快速分化胚狀體和不定芽的基礎(chǔ)。植物組織培養(yǎng)不僅可以加快育種進(jìn)程，而且能降低農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)的成本，更容易優(yōu)化出抗性強(qiáng)的品種，在細(xì)胞水平上為抗性育種材料的篩選及優(yōu)良品種的快速繁殖奠定基礎(chǔ)[8 - 9 ]。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).? 中國(guó)植物志[M].? 北京：科學(xué)出版社，2004.

[2] 陳 敏，廖志華，孫 敏，等.? 生物技術(shù)在長(zhǎng)春花研究中的應(yīng)用[J].? 中草藥，2001，32（1）：78-79.

[3] 陳愛(ài)晶.? 長(zhǎng)春花組織培養(yǎng)技術(shù)研究[D].? 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[4] 嚴(yán)春燕，馬偉麗，于榮敏.? 長(zhǎng)春花愈傷組織誘導(dǎo)及培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].? 中藥材，2008（7）：11-12.

[5] 雷 穎，任俞新，吳利紅，等.? 天水地區(qū)鐵皮石斛組織培養(yǎng)試驗(yàn)研究[J].? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2019（9）：39-41.

[6] 雷 穎，吳莉紅.? 四季秋海棠組培快繁技術(shù)研究[J].? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2015（2）：34-36.

[7] 王 苑，謝凝子.? 植物組織培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象及抗褐變研究進(jìn)展[J].? 黔西南民族師范高等專(zhuān)科學(xué)校學(xué)報(bào)，2007（3）：109-113.

[8] 張 玲，馬 林，楊國(guó)濤.? 黃山藥愈傷組織誘導(dǎo)與分化[J].? 生物技術(shù)，2005（3）：70-73.

[9] 張赫巖.? 金葉楊組織培養(yǎng)技術(shù)的研究[D].? 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

（本文責(zé)編：陳? ?偉）