張?jiān)? 林凡

摘? ?要：鑒于“探究抗生素對(duì)細(xì)菌的選擇作用”教學(xué)活動(dòng)中出現(xiàn)的抑菌圈測(cè)量難題，利用Photoshop軟件自帶的“標(biāo)尺”工具代替游標(biāo)卡尺實(shí)現(xiàn)“卡緊抑菌圈”功能，并通過(guò)“標(biāo)尺”工具所示數(shù)值，計(jì)算出抑菌圈直徑。所得數(shù)值與全自動(dòng)抑菌圈測(cè)量?jī)x法進(jìn)行方差分析，無(wú)顯著差異，是一種適用中學(xué)生物學(xué)教學(xué)實(shí)踐的抑菌圈直徑測(cè)量方法。

關(guān)鍵詞：抑菌圈;測(cè)量;Photoshop

“探究抗生素對(duì)細(xì)菌的選擇作用” 是新編人教版普通高中《生物·必修2·遺傳與進(jìn)化》教材中新增的探究實(shí)踐活動(dòng)[ 1 ]。其教學(xué)目的是引導(dǎo)學(xué)生探討耐藥菌的出現(xiàn)與抗生素濫用的關(guān)系，以落實(shí)對(duì)學(xué)生社會(huì)責(zé)任學(xué)科核心素養(yǎng)的培育。在該教學(xué)活動(dòng)中，教材提供的是常用的微生物敏感性測(cè)定方法——紙片擴(kuò)散法[ 2 ]。測(cè)量抑菌圈直徑是紙片擴(kuò)散法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但教材并未提及具體的測(cè)量方法，此操作也未引起教師重視，通常會(huì)直接選擇直尺進(jìn)行測(cè)量[ 3 ]。由于目前中學(xué)在實(shí)施該教學(xué)活動(dòng)時(shí)多選用玻璃材質(zhì)的培養(yǎng)皿，且培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)皿上皿蓋內(nèi)有冷凝水產(chǎn)生，而玻璃介質(zhì)和冷凝水水滴在燈光照射下會(huì)產(chǎn)生反光現(xiàn)象，導(dǎo)致在普通桌面或臺(tái)面上測(cè)量抑菌圈直徑時(shí)易因光線因素引起測(cè)量誤差;此外，由于抑菌圈的測(cè)量是在培養(yǎng)皿下皿蓋外進(jìn)行，直尺的“0”刻度線也無(wú)法直接接觸抑菌圈的邊緣。因此即使對(duì)同一個(gè)邊界清晰的抑菌圈而言，不同測(cè)量者也難免產(chǎn)生2～5mm誤差。而“探究抗生素對(duì)細(xì)菌的選擇作用”教學(xué)活動(dòng)，需要對(duì)細(xì)菌菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并記錄每代培養(yǎng)物抑菌圈的直徑，此測(cè)量誤差勢(shì)必對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生較大影響，導(dǎo)致無(wú)法準(zhǔn)確探尋到抑菌圈直徑的變化規(guī)律。

經(jīng)文獻(xiàn)檢索，在中學(xué)教學(xué)之外的其他領(lǐng)域，目前普遍使用的抑菌圈測(cè)量法以抑菌圈測(cè)定儀和游標(biāo)卡尺法最為常見(jiàn)[ 3 ]。其中抑菌圈測(cè)定儀自動(dòng)化程度高、測(cè)速快、精度準(zhǔn)，是生產(chǎn)及藥檢部門專業(yè)的測(cè)量工具。但對(duì)中學(xué)教學(xué)實(shí)踐而言，“探究抗生素對(duì)細(xì)菌的選擇作用”是2017年版普通高中生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)中新增的教學(xué)內(nèi)容，且抑菌圈測(cè)定儀價(jià)格昂貴，未被列入各省市普通中小學(xué)教育裝備配備目錄，因此目前中學(xué)一線教學(xué)中尚不具備使用抑菌圈測(cè)定儀的條件。游標(biāo)卡尺法中所用游標(biāo)卡尺是工業(yè)生產(chǎn)中測(cè)量硬性實(shí)物直徑、長(zhǎng)度的工具，測(cè)量時(shí)需卡緊被測(cè)物才能獲得精密準(zhǔn)確的測(cè)量結(jié)果，但瓊脂平板上的抑菌圈非硬性實(shí)物，測(cè)量過(guò)程中無(wú)法實(shí)現(xiàn)“卡緊抑菌圈”的操作，而且普通游標(biāo)卡尺的外卡角短粗，測(cè)量抑菌圈直徑時(shí)會(huì)遮擋視線，因而直接使用游標(biāo)卡尺進(jìn)行抑菌圈直徑的測(cè)量也存在較大測(cè)量誤差[ 3 ]。針對(duì)普通游標(biāo)卡尺使用的不足，顧菊根等曾用改造過(guò)的游標(biāo)卡尺，并自制帶光源的抑菌圈測(cè)量臺(tái)，有效提高了抑菌圈的測(cè)量的精密度[ 3 ]。但此改進(jìn)步驟繁多，因此亦不具備在中學(xué)教學(xué)實(shí)踐中的可推廣性。

通過(guò)實(shí)踐摸索，筆者發(fā)現(xiàn)美國(guó)Adobe系統(tǒng)公司研發(fā)的Photoshop軟件自帶的“標(biāo)尺”工具具有代替游標(biāo)卡尺實(shí)現(xiàn)“卡緊抑菌圈”功能，通過(guò)軟件所示“標(biāo)尺”數(shù)值以及藥敏試紙的實(shí)際直徑，可計(jì)算得出抑菌圈直徑（以下簡(jiǎn)稱PS標(biāo)尺法）。本文對(duì)通過(guò)PS標(biāo)尺法計(jì)算所得抑菌圈數(shù)值與全自動(dòng)抑菌圈測(cè)量?jī)x所測(cè)數(shù)值進(jìn)行方差分析，探討在中學(xué)生物學(xué)教學(xué)實(shí)踐中運(yùn)用PS標(biāo)尺法測(cè)量抑菌圈的可行性。

1? 材料和方法

1.1? 材料和試劑

大腸桿菌DH5α菌株（天根生化科技（北京）有限公司）;藥敏試紙（青霉素10ug;氨芐西林10ug;慶大霉素120μg;頭孢曲松30ug;頭孢他啶30ug;頭孢哌酮75μg;常德比克曼生物科技有限公司）;空白藥敏試紙（常德比克曼生物科技有限公司）;LB固體培養(yǎng)基干粉、LB液培養(yǎng)基干粉（北京索萊寶科技有限公司）;PH-Fix系列測(cè)試條（德國(guó)MACHEREY-NAGEL公司）。

1.2? 方法和步驟

1.2.1? 紙片擴(kuò)散法測(cè)大腸桿菌DH5α菌株對(duì)幾種抗生素的藥敏反應(yīng)

LB固、液培養(yǎng)基配制、DH5α菌種的活化以及無(wú)菌操作詳見(jiàn)人教版教材[ 4 ]。每個(gè)培養(yǎng)皿接種100 μL活化的菌液，用涂布器均勻涂抹于培養(yǎng)基平板，室溫放置3～5min待菌液滲透到瓊脂內(nèi) [ 2 ];再用記號(hào)筆在培養(yǎng)皿底部畫(huà)2條相互垂直的直線，將培養(yǎng)皿等分4個(gè)區(qū)域，取同種藥敏試紙分別貼于其中三個(gè)區(qū)域的中央，以滅菌的空白藥敏試紙貼于剩余的一個(gè)區(qū)域中央以作對(duì)照;將培養(yǎng)皿倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)16h。每種抗生素藥敏反應(yīng)重復(fù)10次。所獲抑菌圈用數(shù)碼照相機(jī)拍照保存，并在Photoshop軟件中打開(kāi)備用。

1.2.2? 抑菌圈直徑的測(cè)量及方差分析

（1）點(diǎn)擊Photoshop軟件菜單欄“視圖”，在彈出的菜單欄中點(diǎn)擊“標(biāo)尺”;點(diǎn)擊菜單欄“編輯”，在彈出的菜單欄中依次點(diǎn)擊“首選項(xiàng)”“單位與標(biāo)尺”，進(jìn)入首選項(xiàng)對(duì)話框，將標(biāo)尺單位設(shè)置為厘米，設(shè)置完畢點(diǎn)擊“確定”并退出;

（2）抑菌圈的邊緣以肉眼看不到細(xì)菌明顯生長(zhǎng)為限。將鼠標(biāo)放在標(biāo)尺內(nèi)部，按住鼠標(biāo)向下拖至抑菌圈上端邊緣，使出現(xiàn)的“標(biāo)尺”輔助線成為抑菌圈上切線，并記錄此輔助線位置數(shù)值，同法在抑菌圈下端再拖出一條平行的輔助線做抑菌圈下切線并記錄位置數(shù)值;如上所述，利用“標(biāo)尺”輔助線再做出藥敏試紙上下平行切線，并記錄切線位置數(shù)值;將上述數(shù)值輸入Excel軟件（Microsoft公司）中，保存待用（圖1）;

（3）利用Excel軟件計(jì)算上下切線位置數(shù)值之差，即得抑菌圈及藥敏試紙直徑的相對(duì)值;所用藥敏試紙均為標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)際直徑大小為6mm，以公式“藥敏試紙實(shí)際直徑/抑菌圈實(shí)際直徑=藥敏試紙相對(duì)直徑/抑菌圈相對(duì)直徑”計(jì)算出抑菌圈實(shí)際直徑;

（4）在Photoshop軟件中將圖片旋轉(zhuǎn)90℃，重復(fù)（2）、（3）步驟，即采用“十”字法對(duì)抑菌圈進(jìn)行兩次互為垂直的直徑測(cè)量，取平均值;

（5）通過(guò)HiCC-T全自動(dòng)抑菌圈測(cè)量?jī)x（簡(jiǎn)稱儀器法）再次測(cè)量上述抑菌圈直徑;

（6）對(duì)上述兩法所得抑菌圈直徑進(jìn)行方差分析。

3? 結(jié)果與分析

用PS標(biāo)尺法和全自動(dòng)抑菌圈測(cè)量?jī)x分別測(cè)定了大腸桿菌DH5α菌株對(duì)6種抗生素的藥敏反應(yīng)，抑菌圈直徑測(cè)量結(jié)果如表1。由表1可見(jiàn)，除青霉素外，一定濃度的氨芐西林、慶大霉素、頭孢曲松、頭孢他啶以及頭孢哌酮對(duì)DH5α菌株均表現(xiàn)出抑菌效應(yīng)。通過(guò)PS標(biāo)尺法和全自動(dòng)抑菌圈測(cè)量?jī)x測(cè)定的抑菌圈直徑誤差均在1mm以內(nèi)，且兩法測(cè)定的抑菌圈直徑?jīng)]有顯著差異。

可見(jiàn)，PS標(biāo)尺法無(wú)需購(gòu)置額外的測(cè)量工具或儀器，亦無(wú)需對(duì)游標(biāo)卡尺進(jìn)行加工改造，每次測(cè)量只需要記錄Photoshop軟件所給出抑菌圈及藥敏試紙上下切線4個(gè)數(shù)值，即可導(dǎo)入Excel軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)的快速計(jì)算，操作簡(jiǎn)便，所得數(shù)值經(jīng)全自動(dòng)抑菌圈測(cè)量?jī)x檢測(cè)，數(shù)據(jù)可靠;同時(shí)依托Excel軟件可實(shí)現(xiàn)對(duì)大批量數(shù)據(jù)的集中快速處理，能很好地滿足中學(xué)教學(xué)實(shí)踐需求。因此，PS標(biāo)尺法是一種適用中學(xué)生物學(xué)教學(xué)實(shí)踐的抑菌圈測(cè)量方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]朱正威，趙占良.普通高中教科書(shū)：生物學(xué)·必修2·遺傳與進(jìn)化[M].北京：人民教育出版社，2019：115.

[2]鐘偉萍.紙片擴(kuò)散法抗菌藥物敏感試驗(yàn)的質(zhì)量控制[J].中國(guó)衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)，2017，14（26）：38-39.

[3]顧菊根，劉莉.抗生素微生物檢定中抑菌圈測(cè)量法的改進(jìn)[J].現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，1997（3）：32-33.

[4]朱正威，孫萬(wàn)儒，趙占良.普通高中課程標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)教科書(shū)：生物·選修1·生物技術(shù)實(shí)踐[M].第二版.北京：人民教育出版社，2007：14-20.