浦延鵬 周佳明

摘 要 目的：探討當歸揮發(fā)油對缺氧/復氧（H/R）損傷大鼠心肌細胞H9C2自噬的調控作用。方法：以大鼠心肌細胞H9C2為對象，在CCK-8法篩選當歸揮發(fā)油最佳給藥濃度和給藥時間的基礎上，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測當歸揮發(fā)油作用后細胞上清液中乳酸脫氫酶（LDH）的活性;以自噬抑制劑（3-甲基腺嘌呤，5 mmol/L）為陽性對照，采用MDC法和Western blotting法分別檢測藥物作用后細胞中MDC的平均熒光強度以及自噬相關蛋白[Beclin-1、微管相關蛋白輕鏈3Ⅱ（LC3Ⅱ）、LC3Ⅰ]的表達情況。結果：經(jīng)0.6 μmol/L當歸揮發(fā)油作用6 h后，與空白組比較，H/R組細胞上清液中LDH活性和細胞中MDC平均熒光強度、Beclin-1表達水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均顯著升高，細胞中p62表達水平顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與H/R組比較，H/R+藥物組細胞上清液中LDH活性，H/R+藥物組和H/R+自噬抑制劑組細胞中MDC平均熒光強度、Beclin-1表達水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均顯著降低，細胞中p62表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結論：當歸揮發(fā)油可通過調控自噬相關蛋白的表達來降低H/R損傷心肌細胞的自噬水平。

關鍵詞 當歸揮發(fā)油;缺氧/復氧;大鼠心肌細胞H9C2;自噬

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）20-2492-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.20.11

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the regulation effects of volatile oil from Angelica sinensis on autophagy of myocardial cell H9C2 in rats with hypoxia and reoxygenation （H/R） injury.? METHODS： Using myocardial cell H9C2 as subject， CCK-8 method was used to screen the optimal concentration and administration time of volatile oil from A. sinensis. The acitivity of LDH in cell supernatant was determined after treated with volatile oil from A. sinensis by ELISA. Using autophagy inhibitors （3-methyladenine， 5 mmol/L） as positive control， MDC method and Western blotting assay were used to detect average fluorescence intensity of MDC and the expression of autophagy related proteins [Beclin-1， microtubule associated protein light chain 3Ⅱ（LC3Ⅱ）， LC3Ⅰ] in H9C2 cells after treated with medicines. RESULTS： After treated with 0.6 μmol/L violate oil from A. sinensis for 6 h， compared with blank group， LDH activity in cell supernatant， average fluorescence intensity of MDC， the expression of Beclin-1， LC3Ⅱ/LC3Ⅰ ratio in cells were increased significantly in H/R group， while the expression of p62 was decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with H/R group， the activity of LDH in cell supernatant of H/R+drug group as well as average fluorescence intensity of MDC， the expression of Beclin-1， LC3Ⅱ/LC3Ⅰratio in cells in H/R+drug group and H/R+autophagy inhibitor group were decreased significantly， while the expression of p62 were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： The volatile oil from A. sinensis can reduce the autophagy level of H/R injury myocardial cells by regulating the expression of autophagy related proteins.

KEYWORDS? ?Volatile oil from Angelica sinensis; Hypoxia/reoxygenation; Myocardial cell H9C2 of rats; Autophagy

缺血性心臟病大多是由冠狀動脈供血不足所致，可引起心肌損傷。如果能及時恢復心臟供血，可恢復心臟功能;但也可能導致心肌損傷加重，造成缺血/再灌注（I/R）損傷[1-2]。在很多情況下，機體會出現(xiàn)I/R損傷，如創(chuàng)傷、收縮后血管回流、經(jīng)冠狀動脈成形術、溶栓治療等，而當受損的缺血心肌組織經(jīng)過干預再次恢復血液灌注時，往往會伴隨著組織損傷加重的可能，引起心功能不全、再灌注心律失常和心肌梗死加重等[3-4]。因此，如何有效改善I/R所致組織損傷成為了學者研究的熱點。

導致心肌I/R損傷的機制較復雜，而自噬在組織損傷中扮演了重要的角色。有研究表明，自噬可降解老化的蛋白質及受損的細胞器，在維持心臟的正常形態(tài)和功能以及改善心肌I/R損傷等方面發(fā)揮了積極作用[5]。但是，自噬對細胞的作用是雙向的，過度自噬也可以造成組織損傷[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，中藥能有效縮小I/R后組織的壞死面積，并能改善相應臟器的功能障礙，其治療機制可能與對自噬作用的調控有關[7]。

中藥當歸以補血通絡為主要功效，常用于胸痹等缺血性疾病的治療，而揮發(fā)油是當歸的主要活性成分之一。已有文獻報道，當歸揮發(fā)油可對大鼠局灶性腦I/R損傷發(fā)揮保護作用[8]，并且對平滑肌[9]、免疫系統(tǒng)[10-12]及心血管系統(tǒng)[13-14]等也有相應的保護作用。但是，當歸揮發(fā)油的作用機制是否與自噬有關，目前尚未得到證實。因此，筆者以當歸揮發(fā)油預處理大鼠心肌H9C2細胞，以缺氧/復氧（H/R）模擬心肌I/R損傷，并選用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）作為陽性對照，探討當歸揮發(fā)油是否能通過調節(jié)自噬對大鼠心肌H9C2細胞的H/R損傷來發(fā)揮保護作用，以期為當歸揮發(fā)油在心肌I/R損傷研究領域中的開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

MCO-15AC型CO2細胞培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）;BX53T-32F01-FLB3型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）;Infinite 200 PRO型多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）;1708625型電泳儀、化學發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）;HS-1800型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）。

1.2 藥品與試劑

當歸揮發(fā)油[甘肅康達藥業(yè)開發(fā)有限責任公司，批號：20190916，含量：81.4%（以藁苯內(nèi)酯計）];自噬抑制劑3-MA對照品（美國Targetmol公司，批號：T1897，純度：98%）;胎牛血清（美國Clark公司，批號：FB25015）;DMEM無糖培養(yǎng)基（批號：90113）、青鏈霉素混合液（批號：P1400）、二甲亞砜（DMSO，批號：D8371）均購自北京索萊寶科技有限公司;0.25%蛋白胰酶（批號：SH30031.02）、DMEM/F12培養(yǎng)基（批號：SH30213.02）均購自美國Hyclone公司;增強型CCK-8試劑盒（上海尚寶生物科技有限公司，批號：ST1006）;細胞自噬染色（MDC法）檢測試劑盒（北京雷根生物技術有限公司，批號：DA0041）;乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（批號：WLA073）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）快速制備試劑盒（批號：WLA013）、BCA蛋白質定量試劑盒（批號：WLA004）、超敏ECL試劑盒（批號：WLA006）、兔源β-actin多克隆抗體（批號：WL0002c）、辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔IgG（H+L）二抗（批號：WLA023a）、兔源Beclin-1多克隆抗體（批號：WL02508）、兔源p62多克隆抗體（批號：WL02385）、RIPA裂解液（批號：WLA014）均購自沈陽萬類生物科技有限公司;兔源微管相關蛋白輕鏈3（LC3）Ⅱ/LC3Ⅰ多克隆抗體（美國Proteintech公司，批號：14600-1-AP）;厭氧產(chǎn)氣包和厭氧培養(yǎng)袋均購自青島海博生物技術有限公司;其余試劑均為分析純或實驗室常用規(guī)格，水為蒸餾水（三級）。

1.3 細胞

大鼠心肌H9C2細胞購自武漢博士德生物工程有限公司。

2 方法

2.1 藥物工作液制備

取當歸揮發(fā)油1 g，加適量DMSO溶解后，以DMEM無糖培養(yǎng)基配制成質量濃度為4.28 mmol/L的母液，于-20 ℃下保存;臨用前，用DMEM無糖培養(yǎng)基稀釋至相應質量濃度的工作液。稱取3-MA適量，以DMEM/F12培養(yǎng)基制成濃度為5 mmol/L的工作液，備用。

2.2 細胞培養(yǎng)

將H9C2細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清及1%青鏈霉素混合液的DMEM無糖培養(yǎng)基中，置于 37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

2.3 H/R損傷細胞模型的建立

參考文獻方法[15]選取缺氧2 h、復氧4 h為模型建立條件：取H9C2細胞，復蘇，待其生長至培養(yǎng)皿的80%～90%時，棄去培養(yǎng)基，以無菌磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）洗滌后，加入不含血清的DMEM無糖培養(yǎng)基，置于厭氧培養(yǎng)袋中（內(nèi)有一個打開的厭氧產(chǎn)氣包）進行密封培養(yǎng)2 h，使細胞缺氧;隨后，以不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基替換DMEM無糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h進行復氧，以建立H/R損傷細胞模型。

2.4 當歸揮發(fā)油對H9C2細胞活力的影響

采用CCK-8法檢測。取對數(shù)生長期的H9C2細胞，用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基制備細胞懸液，并以1×104個/孔接種于96孔板中，每孔100 μL。將細胞隨機分為空白對照組和不同濃度當歸揮發(fā)油組，在37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。以無菌PBS洗滌后，除空白對照組不加藥外，其余各組均加入無菌當歸揮發(fā)油工作液（終濃度分別為0、20、40、60、80、100 μmol/L），每組設置3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)2、4、6 h后，棄上清液，每孔加入無血清DMEM/F12培養(yǎng)基100 μL和CCK-8檢測試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)40 min，采用多功能酶標儀在490 nm波長處檢測各孔的光密度（OD）值并按說明書公式計算各組的相對細胞活力，OD值越高，細胞活力越強[4]。上述試驗重復3次。

2.5 當歸揮發(fā)油對H9C2細胞上清液中LDH活性的影響

采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測。取對數(shù)生長期的H9C2細胞，按“2.4”項下方法制備細胞懸液后，以1×104個/孔接種于96孔板中，每孔100 μL。將細胞隨機分為空白組、模型組（H/R組）、H/R+藥物組（給藥濃度參考“2.4”項下結果，下同），每組設置3個復孔。空白組不作任何處理;H/R組、H/R+藥物組先參照“2.3”項下方法建立H/R損傷模型，藥物組再給予相應藥物。培養(yǎng)適宜時間（時間參考“2.4”項下結果，下同）后，收集各組細胞上清液。參照相應試劑盒說明書，采用多功能酶標儀于450 nm波長處檢測并計算LDH活性。LDH活性越高，則細胞自噬水平越高[5]。上述試驗重復3次。

2.6 當歸揮發(fā)油對H9C2細胞自噬水平的影響

采用MDC法檢測。取對數(shù)生長期的H9C2細胞，按“2.4”項下方法制備細胞懸液后，以5×103個/孔接種于96孔板中，每孔100 μL。將細胞隨機分為空白組、模型組（H/R組）、H/R+藥物組（終濃度同“2.5”項）、H/R+自噬抑制劑組（3-MA終濃度為5 mmol/L[16]）?？瞻捉M不作任何處理;H/R組、H/R+藥物組、H/R+自噬抑制劑組先參照“2.3”項下方法建立H/R損傷模型，各藥物組再給予相應藥物。培養(yǎng)適宜時間后，以無菌PBS輕柔清洗2次，洗去藥物和抑制劑后，每孔加入MDC染色工作液100 μL，于37 ℃、5%CO2條件下避光孵育 15～60 min;然后，各孔加入PBS 100 μL清洗2～3次后，置于熒光顯微鏡下，觀察MDC染色情況，隨機選取3個視野進行拍照，使用Iamge-Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析染色部位的積分光密度（IOD）并計算MDC平均熒光強度。平均熒光強度值越高，則細胞自噬水平越高[6]。上述試驗重復3次。

2.7 當歸揮發(fā)油對H9C2細胞中Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62蛋白表達的影響

采用Western blotting法檢測。取對數(shù)生長期的H9C2細胞，參照“2.6”項下方法接種、分組、造模、給藥，培養(yǎng)適宜時間后，棄去培養(yǎng)液，用PBS輕柔清洗1～2次后，加入RIPA裂解液200 μL和苯甲基磺酰氟（PMSF）2 μL，并進行冰上裂解。細胞充分裂解后，于4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，取上層總蛋白提取液，采用BCA法進行蛋白定量。取蛋白適量，在100 ℃下行變性處理后，進行15% SDS-PAGE，隨后轉移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，以7%脫脂奶粉于室溫下封閉1 h;用TBST溶液清洗10 min×3次，然后加入自噬相關蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62抗體和內(nèi)參β-actin抗體（稀釋度均為1 ∶ 500），4 ℃孵育過夜;以TBST溶液清洗10 min×3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 500），室溫孵育2 h;以TBST溶液清洗10 min×3次，滴加ECL顯影液，在化學發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光成像，采用Image J 1.8.0圖像處理軟件測量各目標蛋白灰度值，并以內(nèi)參蛋白灰度值為參照計算相對灰度值以表示目標蛋白（Beclin-1、p62）的表達水平，同時計算LC3Ⅱ、LC3Ⅰ的灰度值比值（以下簡稱“LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值”）。上述試驗重復3次。

2.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 當歸揮發(fā)油對H9C2細胞活力的影響

與空白組比較，不同濃度當歸揮發(fā)油組細胞在培養(yǎng)2、4、6 h后的相對活力均無顯著變化（P>0.05），且在一定程度上有隨濃度增加而升高的趨勢，并在當歸揮發(fā)油60 μmol/L時達到最高值;且隨處理時間的延長，這一作用越發(fā)明顯，其中以60 μmol/L當歸揮發(fā)油培養(yǎng)6 h時的細胞相對活力最高，故本研究選取上述條件進行后續(xù)試驗。不同濃度當歸揮發(fā)油對H9C2細胞相對活力的影響見圖1。

3.2 當歸揮發(fā)油對H9C2細胞上清液中LDH活性的影響

與空白組比較，H/R組細胞上清液中LDH活性顯著升高（P<0.05）;與H/R組比較，H/R+藥物組細胞上清液中LDH活性顯著降低（P<0.05）。當歸揮發(fā)油對H9C2細胞上清液中LDH活性的影響見圖2。

3.3 當歸揮發(fā)油對H9C2細胞自噬水平的影響

與空白組比較，H/R組細胞的MDC平均熒光強度顯著升高（P<0.01）;與H/R組比較，H/R+藥物組和H/R+自噬抑制劑組細胞的MDC平均熒光強度均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。當歸揮發(fā)油對H9C2細胞自噬水平影響的熒光顯微圖和自噬水平檢測結果見圖3、圖4。

3.4 當歸揮發(fā)油對H9C2細胞中Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62蛋白表達的影響

與空白組比較，H/R組細胞中Beclin-1表達水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均顯著升高，p62表達水平顯著降低（P<0.05）;與H/R組比較，H/R+藥物組和H/R+自噬抑制劑組的Beclin-1表達水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均顯著降低，p62表達水平均顯著升高（P<0.05）。當歸揮發(fā)油對H9C2細胞中Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62蛋白表達影響電泳圖和表達水平檢測結果見圖5、圖6。

4 討論

隨著時代的發(fā)展和生活水平的不斷提高，人們的不良飲食習慣日漸增多;與此同時，高血脂、高血壓、糖尿病等代謝性疾病的發(fā)病率呈增高的趨勢，由此類基礎疾病導致的缺血性心臟病的發(fā)病率也逐年升高，嚴重威脅人們的健康。缺氧和局部缺血后會導致細胞能量供應不足，進而造成心肌損傷，此時應盡快恢復正常的血供以使心臟損傷降至最低;然而在恢復血供的同時，再灌注損傷亦隨之出現(xiàn)，并有可能進一步加重病情[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，I/R所導致的細胞凋亡與自噬密切相關，當發(fā)生I/R損傷后，機體可通過自噬作用來清除受損的細胞器來減少細胞凋亡，從而發(fā)揮保護作用[17]。自噬是細胞的一種自我降解和清除的動態(tài)過程，當機體受到外界刺激而導致細胞器受損時，就會激活自噬作用以清除受損細胞器和蛋白質[18-19]。據(jù)相關文獻報道，有的中藥成分可通過抑制神經(jīng)元的過度自噬來協(xié)助I/R后相應臟器的功能恢復[7]?？梢?，自噬作為I/R損傷中重要的病理變化，已經(jīng)成為學者們研究的熱點[20]。

有研究表明，細胞上清液中LDH的活性可以反映細胞自噬水平，且LDH活性升高，細胞自噬作用增強;同時，選用MDC法可以直觀地評估藥物作用后的細胞自噬水平，即MDC平均熒光強度升高，細胞自噬水平增強[21]。在自噬過程中，LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ是生成自噬體膜的必備物質，是自噬體形成的最重要分子，因此常被作為自噬的標志蛋白，且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高時，細胞的自噬水平亦升高[22];而自噬底物蛋白p62可通過在C端與泛素化蛋白結合，以及在N端與LC3Ⅱ結合，從而參與自噬的降解[23]。因此，通過檢測LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和p62蛋白的表達水平，可以評估細胞自噬水平的高低。此外，在自噬體形成的初始階段，Beclin-1可與Ⅲ型胞內(nèi)磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、p150蛋白結合形成Ⅲ型PI3K復合體，并作為該復合體的中心蛋白，主要發(fā)揮促使自噬體成熟的作用[24];同時，Beclin-1還能與Atg1、Atg9作用，共同參與調控吞噬泡的形成，最終促進自噬的發(fā)生[25]。因此，本研究通過檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1、p62蛋白的表達水平來評價藥物對細胞自噬水平的影響。3-MA是一種特異性針對自噬作用的常用抑制劑，廣泛應用于自噬誘導的研究中[26]，因此筆者選用3-MA作為陽性對照，以對比研究當歸揮發(fā)油對H/R損傷H9C2細胞自噬的影響。結果顯示，與空白組比較，H/R組細胞上清液中LDH活性顯著升高，細胞中MDC平均熒光強度顯著升高，Beclin-1表達水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，p62表達水平降低（P<0.05）。這表明發(fā)生H/R后，細胞的自噬作用增強。與H/R組比較，H/R+藥物組細胞上清液中LDH活性均顯著降低，且H/R+藥物組和H/R+自噬抑制劑組細胞中MDC平均熒光強度均顯著降低，Beclin-1表達水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著減少，p62表達水平均顯著升高（P<0.05）。這表明經(jīng)當歸揮發(fā)油及自噬抑制劑干預后，細胞的自噬作用受到了抑制。

綜上所述，當歸揮發(fā)油能顯著降低H/R損傷心肌細胞H9C2的自噬水平，這一作用與其可降低自噬相關蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ蛋白的表達，增加p62蛋白的表達有關。

參考文獻

[ 1 ] 翟恒博，劉俊.缺血性心臟病再認識[J].心血管病學進展，2016，37（4）：395-400.

[ 2 ] 吳曉燕，苗琳，鄭蕊，等.心肌缺血再灌注損傷的研究進展[J].中國臨床藥理學雜志，2016，32（11）：1043-1045.

[ 3 ] YE Y，YANG M，ZHANG S，et al. Percutaneous coronary intervention versus cardiac bypass surgery for left main coronary artery disease：a trial sequential analysis[J]. Medicine，2017. DOI：10.1097/MD.0000000000008115.

[ 4 ] HAUSENLOY DJ，YELLON DM. Myocardial ischemia- reperfusion injury：a neglected therapeutic target[J]. J Clin Invest，2013，123（1）：92-100.

[ 5 ] 謝鳳，柳威，陳臨溪.自噬參與心臟疾病調控的研究進展[J].生物化學與生物物理進展，2012，39（3）：224-233.

[ 6 ] 王曉茹，安芳.自噬及其在腦缺血再灌注損傷中作用機制[J].神經(jīng)藥理學報，2016，6（1）：41-48.

[ 7 ] 楊海龍，劉春萍，劉建滔，等.基于自噬探討丹蔞片減輕心肌缺血再灌注損傷的機制研究[J].中國中西醫(yī)結合雜志，2020，6（2）：2-6.

[ 8 ] 羅慧英，楊林，楊煥，等.當歸揮發(fā)油對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用[J].中國臨床藥理學與治療學，2012，17（4）：387-391.

[ 9 ] 肖軍花，周健，丁麗麗，等.當歸揮發(fā)油對子宮的雙向作用及其活性部位篩選[J].華中科技大學學報（醫(yī)學版），2003，32（6）：589-596.

[10] 李健蕊，柳鐘勛，左增艷.當歸內(nèi)酯對小鼠細胞免疫功能的影響[J].中藥藥理與臨床，2004，20（5）：13-14.

[11] 馮景奇，柳鐘勛.當歸多糖及當歸內(nèi)酯對小鼠細胞免疫功能的影響[J].中國免疫學雜志，1998，14（4）：279-282.

[12] 馮景奇，柳鐘勛.當歸內(nèi)酯拮抗環(huán)孢菌素A、氫化可的松及抗腫瘤藥物的免疫抑制作用[J].中國免疫學雜志，2000，16（1）：22-24.

[13] 肖軍花，丁麗麗，周健，等.當歸A3部位對心肌生理特性和動作電位的影響[J].中國藥理學通報，2003，19（9）：1066-1068.

[14] 李敏，孫虹，李琰，等.不同產(chǎn)地當歸對血小板聚集及凝血時間活性的比較[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2003，9（2）∶47-50.

[15] 吳世勇.自噬在曲美他嗪保護心肌缺血再灌注損傷中的作用及機制[D].重慶：重慶醫(yī)科大學，2019.

[16] 尚穎.自噬抑制劑3-MA增強順鉑對神經(jīng)母細胞瘤化療效果及其分子機制的研究[D].石家莊：河北醫(yī)科大學，2017.

[17] 王曉茹，安芳.自噬及其在腦缺血再灌注損傷中作用機制[J].神經(jīng)藥理學報，2016，6（1）：41-48.

[18] 李春明，舒適，錢小路，等.自噬與腦缺血再灌注損傷的研究進展[J].中國腦血管病雜志，2015，12（6）：330-333.

[19] KIM H，LEE MS. Autophagy：a key player in cellular and body metabolism[J]. Nat Rev Endocrinol，2014，10（6）：322-337.

[20] WANG JF，MEI ZG，F(xiàn)U Y，et al. Puerarin protects rat brain against ischemia/reperfusion injury by suppressing autophagy via the AMPK-mTOR-ULK1 signaling pathway[J]. Neural Regen Res，2018，13（6）：989-998.

[21] HUANG YG，TAO W，YANG SB，et al. Autophagy：novel insights into therapeutic target of electroacupuncture against cerebral ischemia/reperfusion injury[J]. Neural Regen Res，2019，14（6）：954-961.

[22] LEE YK，LEE JA. Role of the mammalian ATG8/LC3 family in autophagy：differential and compensatory roles in the spatiotemporal regulation of autophagy[J]. Bmb Rep，2016，49（8）：424-430.

[23] LAMARK T，SVENNING S，JOHANSEN T. Regulation of selective autophagy：the p62/SQSTM1 paradigm[J]. Essays Biochem，2017，61（6）：609-624.

[24] SU H，LIU W. PIK3C3/VPS34 control by acetylation[J].Autophagy，2018，14（6）：1086-1087.

[25] KANG R，ZEH HJ，LOTZE MT，et al. The Beclin-1 network regulates autophagy and apoptosis[J]. Cell Death Differ，2011，18（4）：571-580.

[26] 單培仁，余靈芳，黃周青，等.調控自噬對H9C2心肌細胞缺氧/復氧損傷的影響[J].心電與循環(huán)，2013，32（6）：473-477.

（收稿日期：2020-06-14 修回日期：2020-09-21）

（編輯：羅 瑞）