韋仕榮 高玉娟 韋曉陽 蒙 真 覃 俏 黃華生

(1 廣西河池市人民醫(yī)院神經(jīng)內科,河池市 547000,電子郵箱：weishirong8233@163.com；2 廣西柳州市中醫(yī)醫(yī)院腦病科,柳州市 545000)

腦卒中是由于動脈嚴重狹窄或閉塞導致腦組織缺血缺氧的一種臨床常見腦血管疾病,分為缺血性和出血性兩大類,其中缺血性腦卒中占60%～80%；腦卒中好發(fā)于40歲以上人群,且隨著我國老齡人口增多,腦卒中發(fā)病率以每年8%的速度上升,且其病死率、致殘率和復發(fā)率較高,嚴重危害患者生命健康[1-3]。目前對急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke,AIS)尚無統(tǒng)一有效的治療方案,AIS治療時間窗有限,能夠通過有效的溶栓獲救的患者不足3%,因此早期診斷并及時干預對改善患者預后具有重要意義[4]。血清標志物檢測廉價、快捷,逐漸成為評估神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展的重要手段[5]。微小RNA(microRNA,miRNA)可參與基因表觀遺傳調控,在心血管疾病發(fā)生發(fā)展中起重要作用[6]。miRNA-20b可通過抑制血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)生成來減少血管生成[7]。另有研究報道,miRNA-199a可抑制低氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)生成進而調控VEGF表達,在腫瘤血管生成中發(fā)揮重要作用,且miRNA-199a、HIF-1α、VEGF均對AIS病情嚴重程度及預后有不良影響[8-9]。但目前關于血清miRNA-20b、miRNA-199a在AIS中的作用鮮有報道。本研究探討血清miRNA-20b、miRNA-199a水平與AIS患者神經(jīng)功能缺損程度及側支循環(huán)形成的關系,現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年1月至2019年11月河池市人民醫(yī)院收治的126例AIS患者為觀察組,符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[10]關于急性缺血性腦血管病的診斷標準,患者首發(fā)癥狀主要有頭暈頭痛、偏癱、身體單側麻木及語言不清等。納入標準：(1)患者均于發(fā)病后72 h內入院；(2)均經(jīng)頭部CT或MRI檢查確診；(3)患者均為首次發(fā)病,入院前未接受過溶栓治療。排除標準：(1)入院時昏迷的患者；(2)既往有腦卒中病史或神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；(3)合并腦外傷者；(4)頭顱惡性腫瘤或身體其他部位惡性腫瘤出現(xiàn)腦轉移者；(5)患自身免疫性疾病、全身感染性疾病或血液性疾病者。其中男性70例,女性56例,年齡45～80(63.54±8.93)歲。根據(jù)腦側支循環(huán)形成情況分為一級側支循環(huán)組45例，二級側支循環(huán)組41例，三級側支循環(huán)組40例。其中，一級側支循環(huán)組男性24例,女性21例,年齡45～79(61.47±8.62)歲；二級側支循環(huán)組男性23例,女性18例,年齡45～80(62.85±8.73)歲；三級側支循環(huán)組男性23例,女性17例,年齡45～80(63.94±8.41)歲。另選取同期在河池市人民醫(yī)院行健康體檢者126例為對照組。納入標準：體檢健康者。排除標準：嚴重肝腎疾病、自身免疫性疾病、酗酒(平均日飲酒量折合酒精≥125 g，且至少持續(xù)10年)者、冠心病或急性腦梗死者。其中男性73例,女性53例，年齡45～81(64.39±8.76)歲。觀察組和對照組的年齡、性別比較,以及觀察組中3個亞組AIS患者的年齡、性別比較,差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)河池市人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準通過,所有研究對象均對本研究知情同意并簽字確認。

1.2 方法

1.2.1 血清標本采集：采集所有研究對象清晨空腹外周靜脈血5 mL,常溫下3 000 r/min離心15 min,留取血清,置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血清miRNA-20b、miRNA-199a相對表達水平檢測：參照TRIzol試劑盒說明書提取血清總RNA,采用紫外分光光度計(美國貝克曼公司，型號：DU800，檢測波長為260/280 nm)檢測其濃度及純度，OD比值(OD260/280)在1.8～2.1之間表示RNA質量合格。參照反轉錄試劑盒說明書，將獲得的總RNA反轉錄為cDNA(反轉錄條件：16℃，30 min；42℃，30 min；85℃，10 min)，并置于-20℃保存?zhèn)溆谩２捎脤崟r定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)檢測血清miRNA-20b、miRNA-199a水平。TRIzol試劑、反轉錄試劑盒、qRT-PCR檢測試劑盒均購自寶日醫(yī)生物技術北京有限公司(批號：RR0944、RA3352、RK07132)。引物由碧云天生物技術研究所合成。qRT-PCR反應體系共20 μL，包括TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL,ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4 μL,cDNA(50 ng/μL)2 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,雙蒸水6 μL。qRT-PCR反應采用兩步法,條件設置為：95℃,30 s；95℃,5 s；60℃,34 s,40個循環(huán)；添加溶解曲線。miRNA-20b上游引物序列為：5′-TGTCAACGATACGCTACGA-3′,下游引物序列為5′-GCTCTAGTGCAGGTAGAGC-3′；miRNA-199a上游引物序列為5′-TTCACTCCCATCAGTGTCAGCT-3′,下游引物序列為5′-CGTGCTTGTACTCCAGTCTCAA-3′；內參U6上游引物序列為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAA-3′,下游引物序列為5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。采用2-ΔΔCt法定量分析血清miRNA-20b、miRNA-199a水平的相對表達水平。

1.2.3 血清HIF-1α、VEGF水平檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清HIF-1α、VEGF水平,試劑盒分別購自碧云天生物技術研究所(批號：PH368)、美國Invitrogen公司(批號：BMS277-2)。具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 神經(jīng)缺損程度評定方法：按照我國第四屆腦血管病學術會議通過的《腦卒中患者臨床神經(jīng)功能缺損程度評分標準(1995)》[11]評估AIS患者入院時中國卒中量表(China Stroke Scale,CSS)評分,內容包括意識水平、凝視功能、言語、面肌、上肢肌力、手肌力、下肢肌力、步行能力等,總分最高45分,其中0分為正常，1～15分為神經(jīng)功能輕度損傷,16～30分為神經(jīng)功能中度損傷,31～45分為神經(jīng)功能重度損傷。

1.2.5 側支循環(huán)形成分級標準：入院后所有AIS患者均行頭部MRI+磁共振血管造影檢查。磁共振血管造影檢查發(fā)現(xiàn)，Willis環(huán)交通支開放供血，顱外動脈系統(tǒng)通過顳淺動脈-眼動脈血管連接，顱內動脈系統(tǒng)通過軟腦膜與腦膜中動脈血管連接，或不同腦室間軟腦膜血管相互連接形成,即為側支循環(huán)形成。根據(jù)其開放層次分為三級：一級側支循環(huán),主要由Willis環(huán)的血管構成；二級側支循環(huán),腦動脈、軟腦膜及其他相對較小的側支與側支吻合支；三級側支循環(huán)：通過血管生成的方式產生新生血管。側支循環(huán)級數(shù)越高,提示側支循環(huán)形成越良好。

1.3 統(tǒng)計學分析 使用 SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布計量資料以(x±s)表示,兩組間比較用t或t′檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗；偏態(tài)分布計量資料以[M(Q1,Q3)]表示,多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示,兩兩比較采用χ2檢驗。采用Pearson或Spearman法分析血清miRNA-20b、miRNA-199a水平與CSS評分、HIF-1α、VEGF水平的相關性。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩組研究對象的血清miRNA-20b、miRNA-199a相對表達水平的比較 觀察組血清miRNA-20b、miRNA-199a水平均高于對照組(均P<0.05),見表1。

表1 兩組血清miRNA-20b、miRNA-199a相對表達水平的比較(x±s)

2.2 3組AIS患者CSS評分、血清miRNA-20b、miRNA-199a、HIF-1α、VEGF水平的比較 隨著側支循環(huán)級數(shù)增加,AIS患者CSS評分、血清miRNA-20b、miRNA-199a水平均降低,血清HIF-1α、VEGF水平均升高(均P<0.05)。見表2。

表2 3組AIS患者CSS評分、血清miRNA-20b、miRNA-199a、HIF-1α、VEGF水平的比較

2.3 3組AIS患者血清miRNA-20b、miRNA-199a水平與CSS評分、HIF-1α、VEGF水平的相關性分析 AIS患者血清miRNA-20b水平與miRNA-199a水平呈正相關,且血清miRNA-20b、miRNA-199a水平均分別與CSS評分呈正相關,與HIF-1α、VEGF水平呈負相關(均P<0.05)。見表3。

表3 AIS患者血清miRNA-20b、miRNA-199a水平與CSS評分、HIF-1α、VEGF水平的相關性分析

3 討 論

腦側支循環(huán)是指當大腦供血動脈出現(xiàn)嚴重狹窄或閉塞時,血流可通過側支血管到達腦缺血部位,從而使AIS患者腦組織得到不同程度灌注代償。研究顯示,卒中后患者神經(jīng)功能缺損程度與側支循環(huán)形成有關,良好的側支循環(huán)可減少腦缺血發(fā)生率且預示預后良好[12]。

Little等[13]的研究結果顯示,側支循環(huán)良好的AIS患者神經(jīng)功能缺損評分、最終梗死面積及溶栓后再灌注情況明顯好于側支循環(huán)不良者。本研究結果顯示,隨著側支循環(huán)級數(shù)增加,AIS患者的CSS評分依次降低(P<0.05),提示側支循環(huán)形成可能有利于減輕神經(jīng)缺損程度。

VEGF是內皮細胞特異性有絲分裂原,具有促血管生成及促血管通透效應,研究顯示,VEGF水平是冠狀動脈側支循環(huán)形成的影響因素[14]。局部組織缺血缺氧可誘導細胞低氧環(huán)境應答轉錄復合物HIF-1α表達增加,HIF-1α是VEGF上游基因產物,其可通過增加VEGF的表達,促進內皮細胞增生、遷移,增加內皮細胞通透性,促進血管生成,緩解缺血環(huán)境對機體造成的損傷[15]。近來有學者發(fā)現(xiàn),miRNA可通過作用于HIF-1α、VEGF而在神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[16]。其中miRNA-20a在冠心病患者血漿中呈低表達,其可通過調控VEGF表達參與冠狀動脈側支循環(huán)形成[17]。miRNA-20b屬于miRNA-17-92基因簇產物,與miRNA-20a具有高度同源性,其在調控血管生成中發(fā)揮重要作用[18]。劉憶華等[19]的研究顯示,miRNA-20b在肝癌組織中呈高表達,可通過調控HIF-1α、VEGF表達水平促進腫瘤血管生成以適應低氧環(huán)境,并促進肝癌細胞發(fā)生侵襲和轉移?；菟仄G[20]的研究顯示,miRNA-199a定位于19號染色體,與缺血性腦卒中發(fā)生發(fā)展過程中的腦神經(jīng)炎癥反應有關, miRNA-199a-5p在缺血性腦卒中患者血清中呈高表達,且在缺血性腦卒中急性期、亞急性期和恢復期的表達水平呈下降趨勢。茍鳳釵等[21]的研究顯示,miRNA-199a可通過靶向HIF-1α/VEGF通路,抑制缺氧環(huán)境下子宮內膜基質細胞的血管生成。本研究結果顯示,觀察組血清miRNA-20b、miRNA-199a水平均高于對照組(均P<0.05),提示血清miRNA-20b、miRNA-199a水平升高可能與AIS的發(fā)生有關。本研究結果還顯示,隨著側支循環(huán)級數(shù)增加,AIS患者的CSS評分、血清miRNA-20b、miRNA-199a水平均依次降低,血清HIF-1α、VEGF水平均升高(P<0.05),且血清miRNA-20b水平與miRNA-199a水平呈正相關,血清miRNA-20b水平、miRNA-199a水平均分別與CSS評分呈正相關,與HIF-1α、VEGF水平呈負相關(均P<0.05),提示血清miRNA-20b、miRNA-199a水平與AIS患者神經(jīng)功能缺損嚴重程度呈正相關,兩者可能發(fā)揮協(xié)同作用,共同降低HIF-1α、VEGF的表達水平,從而減少側支循環(huán)形成。

綜上所述,AIS患者血清miRNA-20b、miRNA-199a水平均呈高表達,兩者與AIS患者神經(jīng)功能缺損程度呈正相關,并可能通過降低HIF-1α、VEGF表達水平來減少側支循環(huán)形成。但由于本研究樣本量少,且未能進一步分析AIS患者血清中的miRNA-20b、miRNA-199a與HIF-1α、VEGF是否存在直接靶向關系,今后仍需加大樣本量、進一步深入探討。