劉海英，吳 晨，秦紅霖

濟(jì)生腎氣膠囊是由熟地黃、牡丹皮、山茱萸、山藥、茯苓、澤瀉等十位中藥，經(jīng)煎煮提取加工而成的內(nèi)服制劑，臨床常用于腎虛水腫、腰膝酸重的治療。濟(jì)生腎氣膠囊由北京軍區(qū)北戴河療養(yǎng)院研發(fā)此制劑，但原標(biāo)準(zhǔn)中無含量測(cè)定，丹皮酚是該處方的活性成分[1-2]，為更好對(duì)該制劑進(jìn)行質(zhì)量控制，本研究建立了濟(jì)生腎氣膠囊丹皮酚反相高效液相色譜(RP-HPLC)含量測(cè)定方法?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與儀器

1.1儀器設(shè)備 Agilent 1200 Series高效液相色譜儀(美國Agilent)。

1.2材料與試藥 丹皮酚對(duì)照品(中國食品藥品鑒定研究院，批號(hào)：0708-9704)，濟(jì)生腎氣膠囊(北京軍區(qū)北戴河療養(yǎng)院制劑室制備，批號(hào)：130624、131024、131123)甲醇為色譜純，水為自制純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1丹皮酚測(cè)定色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(4.6×250 mm，5 μm)，柱溫為30℃；流動(dòng)相：甲醇-水(55∶45)；檢測(cè)波長為274 nm；流速為1.0 ml/min；進(jìn)樣量為10 μl。

2.2溶液配制

2.2.1對(duì)照品溶液配制：精密稱取丹皮酚對(duì)照品適量，置棕色量瓶中，加適量甲醇制成濃度為51.5 μg/ml的對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液2 ml置于10 ml棕色量瓶中，作為濃度為15.45 μg/ml的對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液配制：取裝量差異項(xiàng)下內(nèi)容物，混合，研磨均勻，取3.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，密塞，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.45 μm濾膜濾過即得。

2.2.3陰性對(duì)照溶液配制：按處方中藥材比例，去除牡丹皮外的其他藥材，按供試品溶液配制的工藝流程制備成不含牡丹皮的陰性對(duì)照溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液10 μl進(jìn)樣檢測(cè)。

2.3專屬性試驗(yàn) 取丹皮酚對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液，按2.1方法檢測(cè)，采用DAD全波長掃描，結(jié)果顯示丹皮酚出峰時(shí)間為49.273 min,陰性對(duì)照溶液未見明顯雜質(zhì)峰干擾，表明濟(jì)生腎氣膠囊組方中的其他成分在該色譜條件下對(duì)丹皮酚的含量測(cè)定未產(chǎn)生影響。理論塔板數(shù)按丹皮酚峰計(jì)>5000，丹皮酚與相鄰峰的分離度>1.5。記錄色譜圖。見圖1。

圖1 濟(jì)生腎氣膠囊的反相高效液相色譜圖

2.4線性關(guān)系考察 精密吸取51.5 μg/ml丹皮酚對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml分別置10 ml棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，各取10 μl，依次注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)：Y=86.3633X(r=0.9995)。結(jié)果表明丹皮酚在2.575～25.75 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5進(jìn)樣精密度考察 取濃度為51.5 μg/ml對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，丹皮酚色譜峰面積的流速精密度(RSD)為0.29%，儀器精密度符合要求。

2.6穩(wěn)定性考察 取供試品溶液(批號(hào)130624)，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析，分別于0、3、5、8、10、12 h進(jìn)樣6次，結(jié)果表明丹皮酚峰面積的RSD 為0.30%，符合要求。

2.7重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次(批號(hào)130624)濟(jì)生腎氣膠囊，按照2.2.2 項(xiàng)下的方法制備供試品溶液6份，并按照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，丹皮酚的平均含量為0.0648 mg/g，RSD為0.95%，重復(fù)性較好。

2.8加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的濟(jì)生腎氣膠囊(批號(hào)：130624)9 份，每份1.5 g，分別精密加入對(duì)照樣品溶液相當(dāng)于中丹皮酚含量的100%，每個(gè)濃度平行做3 份，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。見表1。

表1 濟(jì)生腎氣膠囊中丹皮酚的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9樣品含量測(cè)定 按2.2項(xiàng)下方法制備丹皮酚對(duì)照品溶液和濟(jì)生腎氣膠囊樣品溶液，分別取上述對(duì)照品溶液和樣品溶液各10 μl 進(jìn)樣，依照2.2項(xiàng)下色譜條件分析，外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品中丹皮酚含量，共測(cè)定3批樣(130624、131024、131123)，含量為(0.0648、0.0644、0.0523)mg/g。

3 討論

丹皮酚定量的方法較多，如恒電流庫侖法、紫外分光光度法、但這些方法前處理方法復(fù)雜[3-5]。利用HPLC的高分離性能，可以使丹皮酚與其他成分有效分離，快速測(cè)定多成分中藥制劑中丹皮酚的含量[6]。HPLC是色譜技術(shù)的分支，液體作為流動(dòng)相，高壓輸注系統(tǒng)將極性不同單一溶劑或不同溶劑和緩沖液的混合物的流動(dòng)相泵送至固定相，在色譜柱中的組分分離后，色譜柱進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)品的分析[7-8]。用丹皮酚對(duì)照品溶液在190～600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果在274 nm波長處有最大吸收峰，且干擾較小，故確定檢測(cè)波長為274 nm[9-10]。本研究曾嘗試使用不同濃度的甲醇作為溶劑，超聲、加熱回流提取丹皮酚[11-12]，結(jié)果顯示加熱回流2 h提取效果較超聲效果顯著。用甲醇作為溶劑時(shí)，峰面積和峰形效果最佳。因此確定以甲醇作為溶劑，加熱回流2 h作為提取條件。

在HPLC色譜條件研究中，對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了相關(guān)考察，參考文獻(xiàn)所用流動(dòng)相比例為甲醇-水-冰乙酸(50∶50∶1)[13]，甲醇-水(80∶20)[14]，甲醇-水(45∶55)[1，15]，不同甲醇和水的比例對(duì)峰形、拖尾、分離度有較大影響，經(jīng)反復(fù)調(diào)整比例，最終確立甲醇-水(55∶45)為該制劑的色譜條件。另外，筆者對(duì)不同廠家柱子進(jìn)行了相關(guān)考察，結(jié)果表明耐用性良好。

綜上所述，采用RP-HPLC法測(cè)定濟(jì)生腎氣膠囊中丹皮酚含量，操作方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速且重復(fù)性好、結(jié)果可靠，可以為該膠囊質(zhì)量控制和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。