沈 玲，李海濱，羅玉群，楊 輝

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年約有27萬女性被確診為乳腺癌，是女性最多發(fā)的惡性腫瘤[1]。乳腺癌起源于腺上皮的異常增生，是一種血管依賴性腫瘤，在其增殖、轉(zhuǎn)移過程中需經(jīng)過內(nèi)皮細(xì)胞增殖、侵入、成熟、分化階段形成新的毛細(xì)血管網(wǎng)，是一個(gè)多基因、多因子的作用過程[2-4]。探討乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制及尋找相關(guān)特異性標(biāo)志物一直是臨床研究的熱點(diǎn)問題[5-6]。細(xì)胞黏附分子(CAMs)是一類位于細(xì)胞表面的糖蛋白分子，與惡性腫瘤的發(fā)展相關(guān)，CD15是CAMs的配基之一[7]。Ki-67是細(xì)胞增殖的標(biāo)志指標(biāo)，經(jīng)常用來預(yù)測惡性腫瘤患者的預(yù)后情況[8]。本研究檢測了乳腺癌腫瘤標(biāo)本中CD15、Ki-67的表達(dá)情況，評估了二者與乳腺癌患者臨床病理學(xué)參數(shù)和存活率之間的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年5月—2015年5月我院收治的乳腺癌患者手術(shù)切除的石蠟標(biāo)本和癌旁正常組織(距病變部位>5 cm處，且證實(shí)為無癌浸潤)石蠟標(biāo)本各90例為研究對象。癌組織和癌旁組織全部取樣于女性，年齡37～68(49.64±4.09)歲；TNM分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期50例，Ⅲ期19例；浸潤性導(dǎo)管癌71例，導(dǎo)管原位癌10例，其他類型9例。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1納入標(biāo)準(zhǔn)：①參照《新編常見惡性腫瘤診治規(guī)范》[9]，由術(shù)后病理學(xué)確診為乳腺癌的患者，可以明確腫瘤大小、部位、浸潤程度；②既往未接受過乳腺癌根治術(shù)和放化療的患者。

1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn)：治療期間死亡患者；合并其他惡性腫瘤患者；孕婦；伴隨肺間質(zhì)疾病或嚴(yán)重肝腎功能障礙者；患有血液系統(tǒng)疾病或傳染病等。

1.3免疫組化 采用EnVision TM二步法檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測。

1.3.1切片制備：4 μm厚石蠟組織切片行常規(guī)蘇木精和伊紅染色復(fù)染確認(rèn)。切片經(jīng)烤片、脫蠟、水化后，TBST沖洗3 min×3次。

1.3.2抗原熱修復(fù)：將切片浸泡于檸檬酸鹽熱修復(fù)液中，經(jīng)高壓煮沸2 min，然后室溫放置自然冷卻。TBST沖洗一次。

1.3.3阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：甩去TBST液，每張切片滴加3% H2O2溶液，室溫下孵育10 min。甩去3% H2O2溶液，TBST沖洗3 min×3次。

1.3.4封閉非特異性結(jié)合：甩去TBST液，每張切片滴加5%BSA溶液，室溫孵育1 h。甩去5%BSA液，每張切片滴加100 μl相應(yīng)的一抗∶羊抗人CD15(1∶100)單克隆抗體，兔抗人Ki-67單克隆抗體(1∶100)，將切片置于室溫下孵育1 h。甩去一抗：TBST沖洗3 min×3次。每張切片上滴加100 μl新鮮配制的DAB顯色溶液，在顯微鏡下觀察其顯色情況，顯色時(shí)間為2～3 min。自來水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染3 min，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來水沖洗返藍(lán)5 min。梯度乙醇脫水干燥、二甲苯透明后，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察結(jié)果。以PBS代替一抗作為陰性對照，已知的CD15、Ki-67陽性標(biāo)本為陽性對照。

1.4陽性判定標(biāo)準(zhǔn) 觀察高倍鏡(×400)視野下陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及染色強(qiáng)度：陽性細(xì)胞≤5%計(jì)0分，6%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，≥76%計(jì)4分；細(xì)胞未染色計(jì)0分，淡黃色為1分，棕黃為2分，棕褐為3分；總分=細(xì)胞染色評分×細(xì)胞占比評分，總分≥3分即為陽性表達(dá)[9-10]。結(jié)果評判由2人進(jìn)行雙盲讀片確定。

2 結(jié)果

2.1不同組織CD15、Ki-67表達(dá)情況 乳腺癌組織CD15、Ki-67的陽性表達(dá)率分別為73.33%(66/90)、71.11%(64/90)，癌旁組織CD15、Ki-67的陽性表達(dá)率分別為25.56%(23/90)、31.11%(28/90)。乳腺癌組織中CD15、Ki-67陽性表達(dá)率均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 乳腺癌組織中Ki-67、CD15表達(dá)情況(SP×400)

2.2CD15、Ki-67表達(dá)與乳腺癌臨床病理的關(guān)系 TNM分期Ⅱ～Ⅲ期、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、出現(xiàn)神經(jīng)侵犯、腫瘤直徑≥2 cm的乳腺癌患者CD15、Ki-67表達(dá)水平均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同類型的乳腺癌組織Ki-67陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但不同年齡、腫瘤分化程度、絕經(jīng)情況的乳腺癌患者腫瘤組織中CD15、Ki-67陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 CD15、Ki-67表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理的關(guān)系[例(%)]

2.3乳腺癌組織中CD15、Ki-67表達(dá)相關(guān)性分析 66例CD15陽性表達(dá)的乳腺癌，Ki-67總陽性率為90.91%(60/66)、陰性率為9.10%(6/66)；經(jīng)Spearman相關(guān)性分析可知，乳腺癌組織中CD15與Ki-67表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.406，P=0.008)。

2.4CD15、Ki-67表達(dá)與乳腺癌5年生存率的關(guān)系 90例乳腺癌患者的總生存率為64.44%(58/90)。CD15、Ki-67陽性乳腺癌患者5年生存率均低于CD15、Ki-67陰性者(P<0.05)。見表2。不同CD15、Ki-67陽性表達(dá)乳腺癌患者術(shù)后5年生存率曲線見圖2。

表2 CD15、Ki-67表達(dá)與乳腺癌患者5年生存率的關(guān)系

圖2 不同CD15、Ki-67表達(dá)乳腺癌患者生存曲線

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，近年來隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣的改變，其發(fā)病呈年輕化趨勢[11]。雖然乳腺癌的早期檢測手段和治療方法多樣，但仍有10%的早期患者未能完全治愈，對其身心健康造成了嚴(yán)重影響[12-14]。相關(guān)專家對乳腺癌的產(chǎn)生、發(fā)展相關(guān)的因子進(jìn)行了篩選、研究，但關(guān)于乳腺癌蛋白的表達(dá)及其與臨床病理意義、中遠(yuǎn)期預(yù)后相關(guān)性的研究報(bào)道較少。本研究采用免疫組化檢測了90例乳腺癌組織中CD15、Ki-67的表達(dá)情況，旨在從蛋白質(zhì)分子水平認(rèn)識乳腺癌。

Ki-67是一種與細(xì)胞增殖聯(lián)系密切的抗原，經(jīng)常用于惡性腫瘤增殖能力、增殖程度的評估。賈磊等[15]回顧性分析了肝細(xì)胞癌根治手術(shù)患者的免疫組化結(jié)果，以5年是否復(fù)發(fā)作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，其研究結(jié)果顯示，CD34、Ki-67的高表達(dá)預(yù)示該類患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)更高，提示Ki-67與腫瘤細(xì)胞的增殖能力、生長方式、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為有聯(lián)系。除此之外，Ki-67在指導(dǎo)乳腺癌患者的臨床治療、藥物療效預(yù)測、預(yù)后評估方面均有較高的參考價(jià)值[16-17]。本研究中利用免疫組化法檢測腫瘤組織中Ki-67的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，乳腺癌組織中Ki-67的陽性率顯著高于癌旁組織；同時(shí)Ki-67的陽性率與乳腺癌的TNM分期、神經(jīng)侵犯、腫瘤大小、腫瘤類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示Ki-67上調(diào)與乳腺癌細(xì)胞較強(qiáng)的增殖、轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。

CD15抗原屬CAMs成員，由半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、巖藻糖組成，經(jīng)選擇素識別后確定的CAMs配基之一，位于中性粒細(xì)胞表面。在人體正常組織中，CD15的表達(dá)并不一致，如在胃腸、肺泡、子宮黏膜上皮、乳腺導(dǎo)管上皮組織中的表達(dá)較高，而在食管、皮膚的鱗狀上皮組織中呈低表達(dá)，在心肌、纖維組織等非上皮組織中不表達(dá)[18-19]。戚利坤等[20]研究指出，在乳腺癌組織中CD15的陽性表達(dá)率顯著升高，且與癌的分化程度密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，CD15在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率明顯升高，與乳腺癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示CD15的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化情況相關(guān)，推測是因?yàn)槿橄侔┢鹪从谙偕掀ぎ惓Ｔ錾?，惡變?xì)胞和組織中結(jié)構(gòu)紊亂，影響了CD15的正常表達(dá)。

本研究分析了乳腺癌患者CD15、Ki-67的相關(guān)性，結(jié)果顯示，Ki-67的表達(dá)與CD15呈顯著正相關(guān)，提示二者可相互調(diào)控，推測是Ki-67的上調(diào)，增強(qiáng)細(xì)胞生長與增殖能力，進(jìn)而導(dǎo)致惡性腫瘤中CD15表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移。同時(shí)，本研究中發(fā)現(xiàn)CD15、Ki-67的陽性表達(dá)的乳腺癌患者5年存活率顯著低于陰性表達(dá)患者，與既往研究結(jié)論相似[21]，說明CD15、Ki-67對乳腺癌患者中遠(yuǎn)期的預(yù)后情況有一定的評估價(jià)值。

綜上所述，CD15、Ki-67在乳腺癌中的表達(dá)上調(diào)，與腫瘤臨床病理學(xué)指標(biāo)密切相關(guān)；且二者表達(dá)呈顯著相關(guān)性。由此推測，CD15、Ki-67的高表達(dá)提示乳腺癌的惡化程度較高，轉(zhuǎn)移和侵襲能力強(qiáng)，中遠(yuǎn)期預(yù)后較差。