宋文皓，劉丹梅，楊君

(1.遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院，遼寧丹東118000;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物與科技學(xué)院，成都611130;3.大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116024)

柞蠶Antheraea pernyi屬鱗翅目Lepidoptera天蠶蛾科Saturniidae，是一種完全變態(tài)昆蟲，其地理種群、生態(tài)類型有上百種，分布在我國10多個(gè)省(姜義仁，秦利，2011;劉丹梅等，2019)。柞蠶作為一種野外養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)型昆蟲，為我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展和農(nóng)民致富做出了重大貢獻(xiàn)(徐曉男，2019)。柞蠶蠶絲蛋白對生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用具有很大的潛在價(jià)值(Silva et al.，2019)。柞蠶膿病是由柞蠶核型多角體病毒(Antheraea pernyi nuclear polyhedrosis virus，ApNPV)引起的，是柞蠶養(yǎng)殖的主要病害，主要發(fā)生在幼蟲期和蛹期，染病后的小蠶體和蛹出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀(趙江濤，2018)。由于蠶種、氣象、病原等多種因素，柞蠶膿病容易爆發(fā)，一般年份危害率約15%，大爆發(fā)年份發(fā)病率可達(dá)80%以上。柞蠶膿病目前尚無良藥可防治，預(yù)防措施以消毒為主(徐國東，2013;夏潤璽，秦利，2015;趙江濤，2018)。該病的爆發(fā)會(huì)大大減損蠶農(nóng)養(yǎng)蠶的積極性，使柞蠶的生產(chǎn)及研究嚴(yán)重受限(魏慶國等，2009;張金福，2017)。

免疫卵黃抗體(egg yolk immunoglobulin，IgY)技術(shù)是利用高產(chǎn)母雞接受細(xì)菌、病毒等外來微生物抗原的剌激后產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，生成相應(yīng)抗體且主要富積在雞蛋蛋黃中的特點(diǎn)，以產(chǎn)蛋母雞作為生物反應(yīng)器，大量連續(xù)生產(chǎn)特異性卵黃抗體的技術(shù)(Rǜdiger et al.，2004;李曉宇等，2014;王業(yè)華等，2019)。IgY被美國 FDA認(rèn)定為“公認(rèn)安全類(GRAS)”物質(zhì)。由于IgY不在獸藥或生物制品管理范疇內(nèi)，生產(chǎn)和應(yīng)用無需批準(zhǔn)文號(hào)(李曉宇等，2014)，且更加經(jīng)濟(jì)實(shí)用、綠色高效、免疫原性強(qiáng)、操作便捷、費(fèi)用低，作為一種具有諸多優(yōu)勢的飼料添加劑發(fā)展迅速(邱濤濤等，2019;王業(yè)華等，2019)。研究表明，在家蠶Bombyx mori膿病病毒(何麗華等，2003)、抗豬流行性腹瀉病毒(覃有曼，2019)和大口黑鱸Micropterus salmoides彈狀病毒(袁雪梅等，2019)等的卵黃抗體技術(shù)都取得都了良好的預(yù)防或治療效果。本研究建立了抗ApNPV IgY有效制備的較為完整的技術(shù)體系，用酶聯(lián)免疫試驗(yàn)鑒定了存在抗原和抗體反應(yīng)并測定了其效價(jià)，通過飼喂試驗(yàn)對IgY預(yù)防柞蠶膿病的效果進(jìn)行了探討，為柞蠶膿病的防治探索了一條新途徑。

1 材料及方法

1.1 材料及主要試劑

蒙古櫟Quercus mongolica又稱柞樹，柞樹葉和柞蠶品種青6號(hào)由遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所提供。140日齡蛋雞由大連天德牧業(yè)有限公司提供。

弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigma-Aldrich公司。滅活疫苗組抗原使用雙推法(吳瓊，2013)乳化制成疫苗，冰箱冷藏室保存。

1.2 方法

1.2.1 免疫卵黃抗體的制備和效價(jià)測定 采用皮下肌肉注射滅活疫苗免疫蛋雞獲得抗ApNPV IgY。采集靜脈血，收集血清。在第一次免疫后每周取蛋，第4周進(jìn)行第三次免疫后，每日取蛋，收集卵黃，用蒸餾水稀釋成IgY水溶性組分，以最適抗原濃度進(jìn)行包被，檢測免疫卵黃中的特異性卵黃抗體效價(jià)隨時(shí)間的變化，測定第7天、第14天、第21天、第28天的IgY效價(jià)，4周后測定每天的IgY效價(jià)。其中最適包被濃度選擇陽性對照OD450/630=0.8，且陰性對照OD450/630＜0.1的抗原稀釋液。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 使用最佳包被濃度的病毒液包被，4℃過夜，清洗后37℃封閉2 h。清洗后，將不同免疫周次收集的免疫卵黃水溶性組分按適當(dāng)比例倍比稀釋制成一抗，PBS作空白對照，陰性對照組免疫卵黃水溶性組分按對應(yīng)實(shí)驗(yàn)組稀釋比例進(jìn)行稀釋，加入98孔酶標(biāo)版，溫育。清洗，加入1∶5 000倍稀釋的兔抗雞 IgG-HRP，溫育。清洗，加入TMB(底物)單組份顯色液，室溫避光顯色20 min。每孔迅速加入終止液50 μL。用酶標(biāo)儀檢測，選擇實(shí)驗(yàn)組OD值為陰性對照組，平均值2.1倍條件下的稀釋倍數(shù)作為抗體效價(jià)。

1.2.3 安全性試驗(yàn) 將5 mL稀釋50倍的最高效價(jià)的IgY涂抹到每片柞樹葉上，陰干后分別給1～3齡蠶添食1次，4齡蠶添食2次，5齡蠶添食3次。飼喂抗體葉的為添食組，飼喂未處理的柞樹葉的為空白對照組。

1.2.4 飼喂試驗(yàn) 檢測最高效價(jià)下IgY不同稀釋倍數(shù)和同時(shí)添食IgY對柞蠶膿病的防治效果。將最高效價(jià)IgY一定倍數(shù)的稀釋液涂抹在葉片上，陰干后制成抗體葉;陰干后再涂上ApNPV液，制成抗體-病毒的混合葉。

不同稀釋倍數(shù)的IgY對柞蠶膿病的防治效果方案見表1，將最高效價(jià)的卵黃分別用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋 0、16、32、64、128、256 倍，制成抗體-病毒混合葉飼喂柞蠶;繼續(xù)將發(fā)病率最低的稀釋倍數(shù)的卵黃作為A組，同時(shí)設(shè)置只添加PBS的非免疫卵黃對照B組、只涂抹ApNPV的病毒葉的攻毒對照C組和正常飼養(yǎng)的空白對照D組。添食IgY的試驗(yàn)方案見表2，處理方式1完成后給葉方式更換為處理方式2。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，均在不同的蠶箱分開飼養(yǎng)。

表1 不同稀釋倍數(shù)的免疫卵黃抗體對柞蠶膿病防治試驗(yàn)方案Table 1 Protocol of prevention and treatment of ApNPV disease with IgY of different dilution times

表2 同時(shí)添食免疫卵黃抗體對柞蠶膿病防治試驗(yàn)方案Table 2 Protocol of prevention and treatment of ApNPV disease by adding IgY simultaneously

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)至少進(jìn)行3次，每次3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對各組進(jìn)行比較。數(shù)據(jù)由GraphPad Prism計(jì)算，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原最適包被濃度的確定

當(dāng)抗原濃度為 1.0 μg·mL－1且陽性對照為1∶4 000 時(shí)，OD450/630值最接近0.8(圖1)，且此時(shí)陰性對照的 OD450/630=0.054。因此，選取1.0 μg·mL－1作為最適包被濃度。

圖1 抗原最適包被濃度Fig.1 Optimal concentration of antigen coating

2.2 IgY效價(jià)測定及安全性試驗(yàn)

免疫后的卵黃抗體效價(jià)升高，并且從第三次免疫開始抗體效價(jià)顯著上升，第6周、第7周、第8周效價(jià)達(dá)到最高值(1∶210)并保持不變，隨后效價(jià)開始下降(圖2:A)。因此，選定最高效價(jià)時(shí)的卵黃，在柞蠶飼喂試驗(yàn)中制備復(fù)合飼料。

安全性試驗(yàn)結(jié)果表明，免疫卵黃組和對照組所有重復(fù)區(qū)蠶的死籠率低、繭層率和結(jié)繭率良好(圖2:B～D)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，蠶體無任何異常癥狀。

2.3 抗ApNPV IgY對柞蠶飼喂試驗(yàn)

制備6～8周的雞源IgY，效價(jià)為1∶210，進(jìn)行飼喂試驗(yàn)。

2.3.1 不同稀釋倍數(shù)的IgY對柞蠶膿病的防治效果 稀釋倍數(shù)為64倍時(shí)的發(fā)病率最低，僅1.67%，其他稀釋倍數(shù)的發(fā)病率分別為:0倍13.33%、16倍13.33%、32倍 11.67%、128倍 3.33%和 256倍13.33%(圖3:A)。同時(shí)非免疫卵黃對照組和空白對照組無發(fā)病蠶，證明柞蠶良好，添食方式正確，攻毒對照組中柞蠶膿病發(fā)病率達(dá)98.33%，64倍卵黃稀釋液發(fā)病率極顯著降低(P＜0.000 1)(圖3:B)。

2.3.2 同時(shí)添食IgY對柞蠶膿病的防治效果A'組發(fā)病率為 10%、B'組為 5%、C'組為3.33%、D'組為83.33%，攻毒對照組和空白對照組分別為100%和 0%(圖 3:C)。A'、B'、C'組的發(fā)病率與攻毒對照組之間的差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.000 1)。同時(shí)，與攻毒對照組相比，D'組的發(fā)病率也顯著降低(P＜0.05)。

3 結(jié)論與討論

圖2 免疫卵黃抗體效價(jià)和安全性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 IgY titer and security test results

圖3 免疫卵黃抗體飼喂試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The results of feeding test of anti-ApNPV IgY

卵黃抗體能夠很好地中和特定病毒(張璐等，2017)，相較于其他抗體具有一些顯著的優(yōu)勢:外來抗原的需求量較小(高嶺，2014)、產(chǎn)蛋雞有較長的周期可產(chǎn)生抗體(Edzard et al.，2012)、抗體量較大且成本低、避免了動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等(高嶺等，2013)。柞蠶膿病發(fā)生給蠶養(yǎng)殖業(yè)帶來極大的困難。由于缺乏特效藥物，目前主要是一些消毒手段，操作繁瑣、預(yù)防不徹底、經(jīng)濟(jì)效益低，并且卵黃抗體技術(shù)在柞蠶膿病防治方面的研究和應(yīng)用匱乏。特異性卵黃抗體的有效制備存在安全性問題和技術(shù)難點(diǎn)，如IgY最適包被濃度、抗體效價(jià)、卵黃抗體稀釋倍數(shù)、對特定物種的飼喂方式。本研究采用ApNPV抗原免疫蛋雞制備的特異性多克隆卵黃抗體，通過合理的飼喂可使柞蠶膿病發(fā)病率降低，是預(yù)防柞蠶膿病的良好生物制品。

本研究用滅活的ApNPV免疫產(chǎn)蛋母雞收集卵黃，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定卵黃抗體效價(jià)，并利用合適效價(jià)的卵黃制備柞蠶飼喂試驗(yàn)的復(fù)合飼料。選擇純化ApNPV的OD值為0.396，在免疫效果最佳時(shí)的抗原量為 10 ～1 000 μg·mL－1(Rǜdiger，2001);通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測ApNPV的最適包被濃度為 1.0 μg·mL－1，以此作為測定

何麗華等(2003)用家蠶核型多角體病毒為抗原給蛋雞注射后，獲得卵黃抗體的效價(jià)為1∶160。本研究測得的最高卵黃抗體效價(jià)為1∶210。與家蠶NPV卵黃抗體的效價(jià)差異可能是因?yàn)閮烧邽椴煌锓N，并且檢測效價(jià)的方案不同。死籠率、結(jié)繭率、繭層率被用來判斷家蠶品種的生命力(司馬楊虎等，2007;冉瑞法，2012)，在安全性試驗(yàn)中通過檢測死籠率、結(jié)繭率和繭層率來確定抗ApNPV IgY對柞蠶的正常發(fā)育是否有影響，用稀釋50倍的免疫卵黃與正常食物作為對照飼喂柞蠶，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明抗ApNPV IgY安全可用。此外，IgY的稀釋倍數(shù)(閔嗣璠等，2007;任春芝，2011;趙鵬等，2014)和對動(dòng)物的飼喂方式(何麗華等，2003;李厚偉等，2018)是影響卵黃抗體作用效果的關(guān)鍵因素。因此本研究在柞蠶飼喂試驗(yàn)中，檢測了不同稀釋倍數(shù)的IgY和添食IgY的方式，以此探索Ap-NPV IgY對柞蠶膿病的防治效果。本研究制備的抗ApNPV IgY在選擇正確稀釋倍數(shù)和飼喂方式下可以有效預(yù)防柞蠶膿病及存在治療效果，為Ap-NPV的綜合防治提供了一種有效的預(yù)防手段和參考。效價(jià)的濃度，測得的最高卵黃抗體效價(jià)為1∶210;效價(jià)從第4周開始明顯上升，第6周達(dá)到最高且持續(xù)3周，第8周結(jié)束后開始下降，因此可以選取第6、7、8周的雞蛋大量提取卵黃進(jìn)行安全性試驗(yàn)和制備復(fù)合飼料;安全性試驗(yàn)中免疫卵黃組和對照組的死籠率、繭層率和結(jié)繭率之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明抗ApNPV IgY安全可用;在柞蠶飼喂試驗(yàn)中，測定了6～8周最高效價(jià)的卵黃抗體最佳稀釋倍數(shù)為64倍，此時(shí)柞蠶膿病發(fā)病率最低(1.67%)，說明抗ApNPV IgY能夠顯著降低柞蠶膿病的發(fā)病率;此外，首先飼喂抗體-病毒混合的 A'、B'、C'組的發(fā)病率均極顯著降低，D'組發(fā)病率顯著高于前3組，但也顯著低于攻毒對照組，說明IgY對柞蠶膿病有顯著的預(yù)防作用和治療效果。預(yù)防和治療效果相比，采取預(yù)防手段飼喂柞蠶可以更有效地阻斷柞蠶膿病的發(fā)生。