馬騰，張知曉，戶連榮，劉凌，季梅

(1.青海省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院，青海西寧 810000；2.云南省林業(yè)和草原科學(xué)院，云南昆明 650201)

核桃Juglans regia，學(xué)名胡桃，是多年生落葉喬木，核桃仁是高檔堅(jiān)果，果實(shí)種殼能開(kāi)發(fā)成工藝品，木材是制作高檔家具的原料，其葉子及果皮可以入藥[1]。因其良好經(jīng)濟(jì)社會(huì)價(jià)值，云南省將胡桃作為發(fā)展八大產(chǎn)業(yè)的重要物種，是打造云南“綠色食品牌”的重要組成部分[2]。截至2017年，云南省核桃種植面積達(dá)286.67萬(wàn)hm2，核桃(干果)總產(chǎn)量為115萬(wàn)t，產(chǎn)值318億元，居全國(guó)第一[3]。近年來(lái)，隨著種植面積的快速增加，核桃病蟲(chóng)害發(fā)生情況也愈加嚴(yán)重。在我國(guó)，核桃黑斑病等細(xì)菌病害，以及炭疽病、枝枯病和腐爛病等真菌病害發(fā)生普遍，對(duì)核桃生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響[4]。目前，核桃病害防治仍然依賴化學(xué)藥劑，隨著全社會(huì)對(duì)綠色無(wú)公害食品需求的增加以及生態(tài)環(huán)境保護(hù)意識(shí)的提高，生物防治成為核桃病害防治的發(fā)展方向。

芽孢桿菌具有抗逆能力強(qiáng)、抑菌譜廣等特點(diǎn)，近些年研究較多的如枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens、蠟樣芽孢桿菌B.cereus等，在由絲狀真菌引起的植物病害的生防領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用[5]。芽孢桿菌資源豐富，許多具有生防作用的種類(lèi)有待發(fā)掘研究。芽孢桿菌抑菌譜廣泛，但不同菌株對(duì)病原菌抑制效果不一，且不同芽孢桿菌抑制病原菌的作用機(jī)制不同[6]，因此在發(fā)掘新的生防菌資源時(shí)，有必要對(duì)其抑菌特性進(jìn)行研究。筆者選用前期試驗(yàn)分離驗(yàn)證的具有抑菌效果的一株生防細(xì)菌5-1，測(cè)定其對(duì)核桃病害主要病原真菌的抑菌特性，并進(jìn)行種類(lèi)鑒定，以期為應(yīng)用該生防菌株防治核桃真菌病害、開(kāi)發(fā)新的生防微生物資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉5 g、瓊脂 20 g、蒸餾水 1 L)，用于細(xì)菌培養(yǎng)及形態(tài)鑒定；PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L)，用于病原真菌培養(yǎng)及對(duì)峙培養(yǎng)。

1.1.2 病原真菌 試驗(yàn)地區(qū)常見(jiàn)核桃真菌病害的病原真菌7種，從云南省核桃病害中分離(表1)。

1.1.3 生防細(xì)菌 2019年4月在云南省昆明樹(shù)木園(N 25°8′39″，E 102°44′48″)隨機(jī)挖取 5 份核桃根際土壤樣品，每份10 g。將5份土樣混合后，稱取10 g土樣用無(wú)菌自來(lái)水稀釋，取最適濃度的土壤懸浮液均勻涂布于固體LB平板上，28℃條件下培養(yǎng)48 h，挑選單菌落，劃線純化。選擇病原真菌膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporiodes為指示菌，采用平板對(duì)峙法評(píng)價(jià)分離所得細(xì)菌的拮抗能力。選擇拮抗效果最好的菌株5-1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.1.4 生防菌發(fā)酵液 菌株5-1接種于LB培養(yǎng)液，28℃、140 r/min搖床培養(yǎng)24 h，將菌液濃度稀釋至2×109cfu/mL的活體菌液為活體發(fā)酵液；菌體濃度2×109cfu/mL的活體發(fā)酵液用細(xì)菌濾器過(guò)濾3次后的濾出液為發(fā)酵濾液；2×109cfu/mL的活體發(fā)酵液經(jīng)121℃滅菌20 min后，用細(xì)菌濾器過(guò)濾1次的濾出液為滅菌發(fā)酵液。

1.1.5 病原菌孢子懸浮液 廣布擬盤(pán)多毛孢菌Pestalotiopsis disseminata在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，用無(wú)菌水沖洗分生孢子，離心沉淀并反復(fù)清洗3次后，配制成4×106個(gè)/mL的孢子懸浮液。

1.2 生防菌對(duì)核桃主要病原真菌拮抗作用 采用平板對(duì)峙法測(cè)試生防菌株5-1發(fā)酵液對(duì)核桃7種病原真菌的抑菌效果。用5 mm打孔器沿菌落邊緣選取新鮮的菌絲制成菌餅，單個(gè)菌餅接種在PDA培養(yǎng)基平板中央，用移液器吸取50 μL生防菌活體發(fā)酵液，均勻?qū)ΨQ地接種在距菌餅中央30 mm處的4個(gè)點(diǎn)，以接種無(wú)菌自來(lái)水為對(duì)照，于28℃下培養(yǎng)，每處理3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)7 d后，分別測(cè)量對(duì)照菌落直徑、處理菌落直徑，計(jì)算抑制率。

抑制率(%)＝(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-5mm)×100[7]

1.3 生防菌對(duì)分生孢子的影響 由于廣布擬盤(pán)多毛孢易產(chǎn)孢，且孢子形態(tài)易觀察，因此選擇該病原真菌的分生孢子進(jìn)行試驗(yàn)。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共設(shè)活體發(fā)酵液、發(fā)酵濾液、滅菌發(fā)酵液和121℃滅菌20 min的滅菌自來(lái)水對(duì)照4個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。將分生孢子懸浮液分別和4個(gè)處理液體按1∶1的比例進(jìn)行混和，置于離心管中，28℃、140 r/min搖床黑暗恒溫培養(yǎng)，分別于12 h和24 h后，用無(wú)菌移液器吸取病原真菌分生孢子，在光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)，并拍攝照片。

1.4 生防細(xì)菌鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)觀察 將菌株5-1在LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)[8]。在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后觀察菌落生長(zhǎng)情況，并用革蘭氏染色法制片完成細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的顯微觀察。

1.4.2 生理生化特性測(cè)試 完成菌株5-1的溫度(5～60℃)、pH(4.0～13.0)、NaCl(0～14%)耐受試驗(yàn)，測(cè)定水解淀粉和明膠能力，選擇葡萄糖、麥芽糖、淀粉等碳源及酪氨酸、組氨酸等氮源進(jìn)行唯一碳、氮源的生長(zhǎng)試驗(yàn)[9]。

1.4.3 16S rRNA序列測(cè)定 采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取菌株5-1的基因組總DNA，用細(xì)菌通用引物27F/1495R擴(kuò)增16S rRNA片段，用1%瓊脂糖凝膠電泳回收擴(kuò)增產(chǎn)物，送深圳華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序，獲得基因序列與GenBank中已知的核酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取相關(guān)近緣種序列使用MEGA 4.1軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接距離法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗功能評(píng)價(jià) 菌株5-1對(duì)核桃7種病原真菌均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，其中對(duì)間座殼菌Diaporthe nobilis、鐮孢菌Fusariumsp.、膠孢炭疽菌和廣布擬盤(pán)多毛孢菌抑制效果十分明顯，抑制率超過(guò)40%。對(duì)間座殼菌的抑制率最高，達(dá)到73.7%，對(duì)胡桃楸擬莖點(diǎn)霉Phomopsis juglandina的抑制率最低，僅為24.1%(圖1，表1)。

圖1 生防菌株5－1對(duì)核桃7種病原真菌的拮抗效果Fig.1 Confrontation effect of biocontrol strain 5－1 on 7 species of pathogenic fungus infecting walnut

表1 生防菌株5－1對(duì)核桃7種病原真菌的抑制率Tab.1 Inhibition rate of biocontrol strain 5－1 on 7 species of pathogenic fungus infecting walnut

2.2 對(duì)病原菌分生孢子的影響 生防菌株5-1發(fā)酵液與廣布擬盤(pán)多毛孢混合培養(yǎng)12 h和24 h后，廣布擬盤(pán)多毛孢孢子萌發(fā)情況見(jiàn)表2。與對(duì)照組相比，3組發(fā)酵液均導(dǎo)致分生孢子和菌絲畸變，分生孢子表現(xiàn)為第3色胞明顯膨大，基部無(wú)色胞呈囊泡狀，隨之溶解破裂失去萌發(fā)能力；菌絲表現(xiàn)為頂端膨大分叉變形，生長(zhǎng)能力減弱(圖2，3)。經(jīng)高溫滅菌后發(fā)酵液依然能導(dǎo)致孢子和菌絲畸變，表明菌株5-1發(fā)酵液的功能成分具有較好的熱穩(wěn)定性?；铙w發(fā)酵液比發(fā)酵濾液造成病原真菌孢子和菌絲的畸變更為明顯，表明活體菌群加大了病原孢子畸形及破裂的程度。

表2 生防菌株5－1的發(fā)酵液對(duì)廣布擬盤(pán)多毛孢菌絲和孢子形態(tài)的影響Tab.2 Effect of fermentation broth of biocontrol strain 5－1 on mycelia and spore morphology of Pestalotiopsis disseminata

圖2 生防菌3種發(fā)酵液培養(yǎng)12 h后廣布擬盤(pán)多毛孢孢子的形態(tài)Fig.2 The spore morphology of Pestalotiopsis disseminata after culturing 3 kinds of fermentation broth for 12 h

圖3 生防菌3種發(fā)酵液培養(yǎng)24 h后廣布擬盤(pán)多毛孢菌絲和孢子形態(tài)Fig.3 The mycelia and spore morphology of Pestalotiopsis disseminata after culturing 3 kinds of fermentation broth for 24 h

2.3 生防菌的鑒定

2.3.1 菌株形態(tài) 菌株5-1在固體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，其菌落為淡黃色，邊緣不整齊，表面光滑，中央凸起，不分泌黏液。顯微鏡下觀察到菌體直桿狀，單個(gè)，兩端鈍圓，革蘭氏染色呈陽(yáng)性(圖4)。

圖4 菌株5－1在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d的菌落和菌體形態(tài)Fig.4 Bacterial colony and morphology of strain 5－1 cultured in LB medium for 3 days

2.3.2 生理生化特性 該菌株能利用葡萄糖、淀粉、蔗糖、D-甘露醇、D-木糖、L-阿拉伯糖等多種碳水化合物作為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，卻不能利用麥芽糖和殼聚糖；能利用酪氨酸、組氨酸作為唯一氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，生長(zhǎng)溫度在5～50℃，生長(zhǎng)pH范圍在5.0～9.0，能耐受14%的NaCl；具有水解淀粉和明膠的能力，V-P試驗(yàn)陽(yáng)性，不能利用檸檬酸鹽及丙酸鹽，不能還原硝酸鹽。

2.3.3 16S rRNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析 利用16S rRNA通用引物，以菌株5-1 DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序得到長(zhǎng)度為1 373 bp的16S rRNA基因片段(登錄號(hào)：MT378304)。將測(cè)序獲得的序列在NCBI上進(jìn)行核苷酸同源性比對(duì)，結(jié)果顯示，其與暹羅芽孢桿菌B.siamensis的16S rRNA核苷酸序列同源性最高，達(dá)到99.7%。選取該種相關(guān)近緣種，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，菌株5-1與暹羅芽孢桿菌同聚一支，親緣關(guān)系最近(圖5)。因此，初步鑒定菌株5-1為芽孢桿菌屬。

圖5 菌株5－1的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 16S rRNA phylogenetic tree of strain 5－1

3 結(jié)論與討論

形態(tài)觀察表明該細(xì)菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，LB培養(yǎng)基上菌落呈淡黃色，不分泌黏液；生理生化試驗(yàn)結(jié)果表明該菌株能夠在5～50℃溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，能耐受14%的NaCl，這是區(qū)分暹羅芽孢桿菌與其他芽孢桿菌的重要特征[11]。此外，菌株5-1能夠利用D-木糖，不能利用檸檬酸鹽，這與Sumpavapol等人[12]的研究中對(duì)暹羅芽孢桿菌的描述一致；從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)看，菌株5-1與B.siamensis、B.amylolique-faciens和死亡谷芽孢桿菌B.vallismortis的親緣關(guān)系很近，而文獻(xiàn)報(bào)道后面兩者無(wú)法利用D-木糖，但可以利用檸檬酸鹽[11]。通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化指標(biāo)測(cè)定和分子生物學(xué)等技術(shù)手段，最終確定菌株5-1為暹羅芽孢桿菌。

目前核桃病害防治仍以化學(xué)防治為主，搭配育種及修枝、清落葉等營(yíng)林措施[13]，其中化學(xué)農(nóng)藥難免對(duì)生態(tài)環(huán)境造成破壞，育種及營(yíng)造健康林分需要漫長(zhǎng)周期，生物災(zāi)害突發(fā)時(shí)難以應(yīng)對(duì)。生物防治技術(shù)因其見(jiàn)效快，對(duì)生態(tài)環(huán)境友好，滿足食品安全需求等優(yōu)點(diǎn)，近幾年發(fā)展迅速。關(guān)于暹羅芽孢桿菌，前人已經(jīng)報(bào)道過(guò)其拮抗真菌的特性，如對(duì)細(xì)極鏈格孢菌Alternaria tenuissima[14]、禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum[15]、尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum[16]、粉紅單端孢Trichothecium roseum和擬盤(pán)多毛孢Pestalotiopsis paeoniicola、半裸鐮刀菌Fusarium semitectum、毀滅柱孢Cylindrocarpon destructans[17]等多種病原真菌均有一定的抑制活性。本研究中，菌株5-1能對(duì)7種核桃病原真菌產(chǎn)生抑菌作用，結(jié)合前人的相關(guān)研究表明，暹羅芽孢桿菌是一種潛力生防菌，抑菌能力強(qiáng)，抑菌譜廣；菌株5-1經(jīng)液體發(fā)酵后能夠使病原真菌廣布擬盤(pán)多毛孢的分生孢子及菌絲畸形，進(jìn)而抑制其生長(zhǎng)，菌群黏附性強(qiáng)，且抑菌能力穩(wěn)定。這些特征表明其在核桃真菌病害生防領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。然而關(guān)于該菌株的研究才剛剛起步，要將其應(yīng)用于核桃病害的生物防治還需對(duì)其代謝途徑、功能機(jī)理等進(jìn)行深入研究，同時(shí)還要開(kāi)展大量的田間防效試驗(yàn)。