陳靖 張偉華 許晨

1天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院胰腺腫瘤科，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室300060；2天津市人民醫(yī)院肛腸外科300191

0 引 言

胰腺癌因其極高的病死率和惡性度，被認(rèn)為是世界上惡性度最高、進(jìn)展最快和結(jié)局最差的癌癥之一[1]。2019 年，美國胰腺癌患者人數(shù)為56 770 例，其中由于胰腺癌死亡的患者高達(dá)45 750 例。胰腺癌發(fā)病率位于美國癌癥發(fā)病率的前10 位，雖然其發(fā)病率沒有男性前列腺癌和女性乳腺癌高，但是其病死率高居所有腫瘤的第4 位。盡管胰腺癌的診療技術(shù)已有所進(jìn)步，但在所有級別的胰腺癌中，患者5 年生存率僅為9%[2]。胰腺癌的主要危險因素為吸煙、慢性胰腺炎家族病史、非O 型血[3]以及職業(yè)風(fēng)險等[4]。胰腺癌最主要的2 種類型是胰腺腺癌和內(nèi)分泌腫瘤，前者約占所有病例的85%左右，是胰腺癌的主要類型[5]。由于胰腺癌的進(jìn)展十分迅速，其確診后5 年生存率很低。雖然手術(shù)切除是包括胰腺癌在內(nèi)的所有腫瘤治療的基石，但是一般只有不到20%的胰腺癌患者可以接受手術(shù)切除，且一般發(fā)生在晚期，許多胰腺癌患者在行根治性手術(shù)后仍會復(fù)發(fā)。目前，輔以放療、化療、靶向治療和中藥治療后，胰腺癌患者的預(yù)后已經(jīng)得到很大的改善[6]。但目前，尚缺乏用于胰腺癌早期發(fā)現(xiàn)的有效且靈敏的診斷手段，主要方式是腹部不適之后的電子計算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）及核磁共振檢查，此時確診患者一般已達(dá)晚期。因此，發(fā)掘一種新型而靈敏的生物標(biāo)記物，有助于對胰腺癌的認(rèn)識、檢測及治療，從而進(jìn)一步改善患者預(yù)后。

β-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶3（β-1,3-N-acetylglucosamine aminotransferase 3，B3GNT3）屬于β3GlcNAcT 基因家族。B3GNT3 基因位于19q13.1 染色體上，該家族至少包括8 個不同的β3GlcNAcTs[7]。B3GNT3 屬于Ⅱ型跨膜蛋白，負(fù)責(zé)聚N-乙酰氨基乳糖胺鏈的生物合成和二聚唾液酸路易斯A 的骨架結(jié)構(gòu)，并在L-選擇素配體的生物合成中起重要作用。許多β3GlcNAcT 家族成員與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。例如，與非侵襲性膀胱癌相比，B3GNT2在侵襲性膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)大大降低，表明B3GNT2 可能參與了腫瘤的進(jìn)展[8]。多項研究結(jié)果表明，B3GNT3 的表達(dá)量與很多惡性腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展相關(guān)，如宮頸癌[9]、非霍奇金淋巴瘤[10]、非小細(xì)胞肺癌[11]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[12]及結(jié)腸癌等[13-14]。近年來，研究者也證明了B3GNT3 可促進(jìn)肺癌的進(jìn)展及不良預(yù)后[15]。上述研究結(jié)果提示，B3GNT3 可能作為多種腫瘤的診斷生物標(biāo)志物及相關(guān)治療的潛在生物靶點。然而，關(guān)于B3GNT3 在胰腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義的研究還很少，有待于進(jìn)一步探究。本研究旨在探究B3GNT3 在胰腺癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。本研究結(jié)果有助于進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)B3GNT3 在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，為胰腺癌的早期發(fā)現(xiàn)和臨床檢測、治療提供了新的思路，對于胰腺癌患者的預(yù)后分析也有重要的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2013 年3 月至2018 年3 月，天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院收治的經(jīng)手術(shù)治療的胰腺癌患者78 例。其中，男性44 例，女性34 例，年齡53.2 歲±12.1 歲。全部病例均經(jīng)過臨床病理證實，并具有完整的病例資料。收集患者的腫瘤組織標(biāo)本和相應(yīng)的癌旁正常組織樣本。根據(jù)AJCC-TNM-2010 分類系統(tǒng)和WHO/ISUP-2016 系統(tǒng)分別評估腫瘤分期和分級。本研究以1964 年赫爾辛基宣言和隨后所有修訂案中規(guī)定的道德標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要材料與儀器

二氨 基 聯(lián) 苯 胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）（美國Cell Signaling Technology 公司），免疫組化Anti-B3GNT3 抗體（ab251758，美國Abcom 公司）。

RM2235 型石蠟切片機(jī)（德國Leica 公司），CX33型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測

將病理組織石蠟包埋并切片，此后放入65 ℃的烘箱中20 min，使石蠟變軟。將組織切片充分浸入二甲苯溶液中處理5 min，取出后再置于另一新的二甲苯溶液中繼續(xù)浸泡5 min，梯度乙醇溶液處理（100%、95%、90%、80%，各5 min）。取出組織切片并置于流水下沖洗，以充分去除乙醇?xì)埩?。將處理過的組織切片放入盛滿磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）的抗原修復(fù)盒中洗滌5 min，重復(fù)3 次。將組織切片置于盛滿0.01 mol 枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液（pH=6.0～6.5）的抗原修復(fù)盒中，封蓋后在微波爐中高火處理5 min，中低火處理10 min，取出后冷卻至室溫。用PBS 緩沖液洗滌切片5 min，重復(fù)3 次，用濾紙擦干切片上多余液體，將切片置于濕盒中，每張切片滴加體積分?jǐn)?shù)為3%的H2O2溶液40 μl，避光孵育20 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。用PBS洗滌5 min，重復(fù)3 次，再次用濾紙擦干切片上多余液體。將切片置于濕盒中，每張切片滴加一抗40 μl，4 ℃避光過夜孵育。次日拿出濕盒復(fù)溫30 min 后，用PBS 洗滌5 min，重復(fù)3 次，并用濾紙擦干切片上多余液體。將切片置于濕盒中，每張切片滴加二抗1 滴，室溫下避光孵育1 h。用PBS 洗滌5 min，重復(fù)3 次，用濾紙擦干切片上多余液體。每張切片滴加配好的DAB 工作液50 μl，染色2 min 后，用自來水沖洗5 min 終止染色。用50 μl 蘇木素，復(fù)染30 s 后，用自來水沖洗5 min 終止染色。將組織切片用梯度乙醇溶液處理（75%、1 min，85%、1 min，95%、1 min，100%、1 min，100%、3 min），然后將組織切片充分浸入二甲苯溶液中處理5 min，取出后再置于另一新的二甲苯溶液中繼續(xù)浸泡5 min。最后，用中性樹膠進(jìn)行封片，晾干，用顯微鏡觀察并采集圖像。

顯微鏡觀察時，隨機(jī)選取5 個不同的視野，依照陽性細(xì)胞比例和陽性染色強(qiáng)度2 個指標(biāo)評定組織切片中B3GNT3 的染色水平。陽性細(xì)胞比例評分標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤細(xì)胞陽性百分?jǐn)?shù)為0%時，記為0 分，1%～29%時，記1 分，30%～65%時，記2 分，66%～100%時，記3 分。陽性染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：陰性染色記0 分；低度染色記1 分；中度染色記2 分；高度染色記3 分。以陽性細(xì)胞百分比評分和染色強(qiáng)度評分的乘積判斷表達(dá)情況，其中結(jié)果＜1 分時，記為0 分；結(jié)果為1、2 或3 時，記為1 分；結(jié)果為4 或6 時，記為2 分；結(jié)果為9 時，記為3 分。

1.2.3 臨床樣本生物信息學(xué)分析

通過基因表達(dá)譜交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫獲取臨床樣本350 例，其中包括179 例胰腺癌組織樣本和171 例癌旁正常組織樣本。通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析B3GNT3 的mRNA 在胰腺癌組織和癌旁正常組織中的差異。

1.4 數(shù)據(jù)學(xué)方法

采用Graphpad 7.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。定量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。兩組比較時，采用t 檢驗；比較臨床病理特征與蛋白表達(dá)間的關(guān)系時，采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果

B3GNT3 在多種腫瘤中異常表達(dá)并提示不良預(yù)后。為了更好地闡明B3GNT3 在胰腺癌中的作用，通過GPEIA 分析B3GNT3 的mRNA 在胰腺癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)情況，共分析胰腺癌組織179 例及癌旁正常組織171 例。結(jié)果表明，B3GNT3的mRNA 在胰腺癌組織中顯著高表達(dá)（P＜0.05）（圖1）。為了進(jìn)一步證明B3GNT3 在胰腺癌進(jìn)展演變中發(fā)揮的作用，利用Kaplan-Meier 分析B3GNT3 與胰腺癌患者預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果表明，B3GNT3 表達(dá)較高的患者中，總生存率和無病生存率都較低（圖2A和2B）。上述結(jié)果提示，B3GNT3 在胰腺癌組織中的表達(dá)水平偏高，并與胰腺癌患者的預(yù)后生存期相關(guān)。

圖1 胰腺癌中β-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶3（B3GNT3）的mRNA 表達(dá)

2.2 B3GNT3 在各種腫瘤組織中的表達(dá)

生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，B3GNT3 在多數(shù)常見腫瘤中的表達(dá)是陰性的，而在甲狀腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌及胰腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)（圖3）。因此，進(jìn)一步探究了B3GNT3 蛋白在結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌及肝癌中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，B3GNT3 在乳腺癌中也明顯高表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)B3GNT3 主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)（圖4）。

2.3 B3GNT3 在胰腺癌組織中的表達(dá)

為了探究B3GNT3 在胰腺癌的進(jìn)展中的角色。本研究中，運用免疫組織化學(xué)染色方法檢測78 例胰腺癌組織中的B3GNT3 的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，B3GNT3 主要定位于胞漿，其表達(dá)量在胰腺癌組織中明顯高于癌旁正常組織（圖5A）。根據(jù)染色的強(qiáng)度，將胰腺癌患者分為B3GNT3 高表達(dá)組和B3GNT3 低表達(dá)組（圖5A）。分組后發(fā)現(xiàn)，B3GNT3 在癌旁正常組織中的表達(dá)量顯著降低（圖5B）。上述結(jié)果提示，B3GNT3 與胰腺癌的進(jìn)展明顯相關(guān)。

2.4 B3GNT3 蛋白表達(dá)水平與胰腺癌患者的臨床病理特征的相關(guān)性

為了闡明B3GNT3 在胰腺癌進(jìn)展中的作用，分析比較了B3GNT3 高表達(dá)組和B3GNT3 低表達(dá)組患者的臨床病理特征差異，包括年齡、性別、腫瘤分期、腫瘤分級、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。分析結(jié)果表明，B3GNT3 在胰腺癌組織中的高表達(dá)與腫瘤分期（P=0.014）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.013）和腫瘤大?。≒=0.004）明顯相關(guān)，而與性別、年齡以及腫瘤分級無關(guān)（均P＞0.05）。（表1）

圖2 β-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶3（B3GNT3）表達(dá)與胰腺癌患者生存率的相關(guān)性

圖3 β-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶3（B3GNT3）在部分腫瘤患者中的表達(dá)情況

圖4 β-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶3（B3GNT3）在幾種常見腫瘤中的免疫組化結(jié)果（×200）

圖5 胰腺癌組織和癌旁正常組織中β-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶3（B3GNT3）的免疫組化結(jié)果

表1 β-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶3（B3GNT3）蛋白表達(dá)與胰腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

2.5 B3GNT3 作為胰腺癌潛在生物標(biāo)記物分析

上述結(jié)果提示，B3GNT3 可能是胰腺癌的一種潛在預(yù)后相關(guān)生物標(biāo)記物。因此，對B3GNT3 作為肺癌與胰腺癌的預(yù)后標(biāo)記物，進(jìn)行了可能性分析。結(jié)果表明，B3GNT3 在2 種腫瘤中均可發(fā)揮顯著的預(yù)后生物標(biāo)記物作用，且在胰腺癌中更加明顯（圖6）。該結(jié)果提示，B3GNT3 有望在胰腺癌的預(yù)后預(yù)測中發(fā)揮作用，并有望成為靶向治療的靶點。

圖6 β-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶3（B3GNT3）作為肺癌和胰腺癌的預(yù)后標(biāo)記物的可能性分析

3 討論與結(jié)論

胰腺癌是一種具有高度侵襲性和惡性的腫瘤，其患者死亡率很高[16]。手術(shù)切除對早期胰腺癌患者有效，但由于胰腺癌的早期癥狀隱匿，至使早期診斷率較低，很多患者往往被診斷時即為晚期。晚期胰腺癌的手術(shù)切除率相對較低，常常導(dǎo)致預(yù)后不良。盡管近年來關(guān)于胰腺癌的診療技術(shù)取得了巨大進(jìn)步，分子診斷和靶向治療技術(shù)不斷完善，但胰腺癌仍是一種死亡率很高的高度侵襲性疾病。目前，針對胰腺癌，仍然缺乏有效的用于預(yù)防、診斷，以及轉(zhuǎn)移和預(yù)后預(yù)測的生物標(biāo)志物[17]。大量的研究結(jié)果表明，B3GNT3 在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮巨大作用。B3GNT3 是19q13.1 擴(kuò)增的一個新的生物標(biāo)志物，在結(jié)腸癌、宮頸癌、食管癌、肝癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、非霍奇金淋巴瘤以及非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，尤其是在神經(jīng)母細(xì)胞瘤和非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)更為明顯。本研究中，基于生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)B3GNT3 在多種腫瘤中高表達(dá)，B3GNT3 在胰腺癌組織中的mRNA 表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，且B3GNT3 表達(dá)較低的胰腺癌患者的總生存率和無病生存率都較高。這些結(jié)果與其他研究者對B3GNT3 與其他腫瘤進(jìn)行研究后所得出的結(jié)論是一致的。

為了進(jìn)一步探究B3GNT3 在胰腺癌的進(jìn)展中的作用，對78 例患者的胰腺癌組織進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果表明，B3GNT3 在胰腺癌組織中的表達(dá)量要比癌旁正常組織高很多。Cerhan 等[10]發(fā)現(xiàn)，B3GNT3 與免疫功能和炎癥有關(guān)，并在淋巴細(xì)胞運輸和遷移中起著重要的作用，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的生存和轉(zhuǎn)移。本研究中發(fā)現(xiàn)B3GNT3 在胰腺癌組織中的高表達(dá)與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小明顯相關(guān)（均P＜0.05），但與性別、患者年齡和腫瘤復(fù)發(fā)的相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。該結(jié)果與先前得出的B3GNT3 與癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的結(jié)論相一致，但關(guān)于B3GNT3 與癌癥復(fù)發(fā)的關(guān)系，二者結(jié)果相異，有待于進(jìn)一步通過實驗來分析具體原因。研究結(jié)果表明，B3GNT3 的基因座與胰腺癌中CA19-9 水平相關(guān)[14]。本研究結(jié)果表明，B3GNT3 在甲狀腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌及胰腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，且B3GNT3 往往與腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)。本研究中，初步證實了B3GNT3 與胰腺癌之間的關(guān)系，為進(jìn)一步探究B3GNT3 與胰腺癌的相關(guān)性奠定了研究基礎(chǔ)。B3GNT3 與胰腺癌臨床病理的相關(guān)性與大多數(shù)腫瘤類似，其與B3GNT3 在大多數(shù)腫瘤上發(fā)揮的作用相類似。

綜上，本研究的結(jié)果有助于進(jìn)一步理解和認(rèn)識B3GNT3 與胰腺癌的關(guān)系?；贐3GNT3 與胰腺癌之間的關(guān)系，可以認(rèn)為B3GNT3 有望成為胰腺癌重要的治療靶點和一個潛在的生物標(biāo)志物，但是具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。下一步的研究將更加全面地分析B3GNT3 在胰腺癌中的功能，其中將通過構(gòu)建B3GNT3 基因質(zhì)粒表達(dá)載體，將其過表達(dá)或沉默，并觀察其功能學(xué)行為的改變，并將構(gòu)建小鼠模型等來研究B3GNT3 對胰腺癌的增值、遷移以及腫瘤形成等方面的影響，以期進(jìn)一步探索B3GNT3 對胰腺癌的分子作用機(jī)制。