李泉曉 馮雙雙 張愛蓮

新疆大學生命科學與技術學院，新疆生物資源與基因工程重點實驗室，烏魯木齊830046

0 引 言

中草藥常被用來治療各種疾病，其水提物有效成分主要為多糖、生物堿、苷類和揮發(fā)油等[1-3]。大量研究結果證明，中草藥提取物是重要的免疫調節(jié)劑[4]。例如中草藥成分中的多糖可激活機體免疫細胞，包括T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、樹突狀細胞（dendritic cells,DCs）、自然殺傷細胞及巨噬細胞等；此外還可活化補體，刺激抗體分泌和促進細胞因子產(chǎn)生，在增強免疫力中發(fā)揮著重要作用[5-7]。近年來，中草藥提取物用于抗腫瘤藥物及疾病疫苗佐劑的研究已成為熱點。中草藥多糖包括白芷多糖、牛膝多糖、菊粉多糖、甘草多糖、一枝蒿多糖等，可顯著提高腫瘤患者的免疫力，通過機體自身免疫功能殺傷腫瘤細胞，從而減輕化學藥物治療和放射治療對免疫器官的損傷，其作為流感病毒、艾滋病病毒、乙型肝炎病毒等疫苗佐劑可顯著增強疫苗的免疫效果[8-12]。

DCs 是體內專職的抗原呈遞細胞，其主要功能是捕獲、加工、提呈抗原給初始T 淋巴細胞[13]。中草藥提取物尤其是多糖可通過與DCs Toll 樣受體結合促進DCs 成熟，進而釋放促炎癥因子、細胞因子及趨化因子等，使宿主產(chǎn)生一種強烈的免疫反應對抗外界病原體[14-15]。DCs 成熟的一個重要標志為共刺激分子CD40、CD80、CD86 和主要組織相容性復合體-Ⅱ的上調。這些共刺激分子也為T 細胞活化提供了重要信號[16]。

新疆一枝蒿為菊科巖蒿植物，以全草入藥。其提取物包含多糖、黃酮等，其中多糖類化合物具有降低炎癥反應、抑制腫瘤生長及抗病毒等多種生物學功能[17]。筆者所在課題組前期研究結果發(fā)現(xiàn)，新疆野生一枝蒿粗多糖（wild Artemisia rupestris L.crude polysaccharides,WARCP）在體外可刺激DCs 成熟，其作為佐劑可顯著提高疫苗的免疫效力[18]。然而對于新疆一枝蒿的最佳儲存溫度與狀態(tài)了解甚少，故本研究通過檢測WARCP 和新疆栽培一枝蒿粗多糖（cultivated Artemisia rupestris L.crude polysaccharides,CARCP）對DCs 表面分子CD40 和CD86 表達的影響，來探討兩者于不同溫度（4 ℃、-20 ℃、-80 ℃）儲存時的免疫調節(jié)活性差異，為新疆一枝蒿保持良好的免疫調節(jié)活性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

新疆野生一枝蒿、新疆栽培一枝蒿（市售），青霉素-鏈霉素溶液（雙抗）、RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國HyClone 公司），胎牛血清（以色列Biological Industries公司），藻紅蛋白（phycocyanin，PE）標記的抗小鼠CD11c 抗體、異硫氰酸熒光素（flourescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記的抗小鼠CD40 抗體、別藻藍蛋白（allophycocyanin，APC）標記的抗小鼠CD86 抗體（美國BD 公司），鼠源粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（美國PeproTech 公司），脂多糖（美國Sigma 公司），石油醚、無水乙醇、正丁醇（天津市富宇精細化學品開發(fā)有限公司）。

健康清潔級6～8 周齡C57BL/6 雌性小鼠12 只，體質量范圍18～22 g，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號SCXK（新）2003-0001。小鼠于動物房內分籠飼養(yǎng)，溫度（22±2）℃，相對濕度（55±10）%，光照節(jié)律為12 h 光照/12 h 黑暗，自由進食飲水。本研究所有的動物實驗均獲得新疆大學動物實驗倫理委員會的批準。

TD-5Z 臺式低速多管架離心機（四川蜀科儀器有限公司），BD FACSCalibur 流式細胞儀（美國BD公司），Heal Force 生物安全柜[力新儀器（上海）有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 WARCP 和CARCP 的制備與儲存

取整株新疆野生一枝蒿和新疆栽培一枝蒿于60 ℃烘箱中干燥，粉碎后用1 L 無水乙醇溶解100 g粉末，混勻，超聲1 h；沉淀干燥后，加入1 L 石油醚混合超聲1 h，抽濾干燥；再加入1.5 L 蒸餾水超聲2 h，旋蒸濃縮至200 ml；加入無水乙醇溶液使?jié)饪s液的體積分數(shù)為80%，4 ℃醇沉24 h，抽濾干燥即得WARCP 和CARCP 粉末。然后采用Sevage 法[19]對WARCP 和CARCP 粉末進行除蛋白，具體步驟如下：分別取適量WARCP 和CARCP 粉末，加入100 倍體積的蒸餾水，攪拌均勻直至充分溶解；將氯仿與正丁醇按體積比4∶1 混合（Sevage 試劑），加入上述多糖溶液中混勻進行除蛋白，重復此步驟直至蛋白被充分去除；旋蒸濃縮，加入無水乙醇使?jié)饪s液的體積分數(shù)為80%后進行醇沉，抽濾干燥得到去除蛋白的WARCP 和CARCP 粉末。采用蒽酮-硫酸法[17]測定多糖含量，測得WARCP 粉末的多糖含量為30.94%，CARCP 粉末的多糖含量為31.86%。分別取適量WARCP 和CARCP 粉末分裝后置于4 ℃、-20 ℃和-80 ℃冰箱中儲存6 個月；另取適量WARCP 和CARCP 粉末分別溶于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）中，過濾除菌，配成質量濃度為10 mg/ml 的母液，置于4 ℃、-20 ℃和-80 ℃冰箱中儲存6 個月后用于后續(xù)研究。

1.2.2 小鼠髓系DCs 的獲取

頸椎脫臼法處死C57BL/6 小鼠，于體積分數(shù)為75%的乙醇中浸泡2～3 min；剪取后腿脛骨和股骨，剔肉后置于PBS 中；再置于體積分數(shù)為75%的乙醇中消毒1～2 min，PBS 洗4 遍；剪去兩端骨頭，用1 ml注射器吸取RPMI-1640 培養(yǎng)基沖出骨髓，200×g 離心7 min，棄上清；用含有質量濃度為20 ng/ml 粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子和體積分數(shù)為10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基重懸細胞，以1×106個/ml的濃度接種于細胞培養(yǎng)皿中，每皿6 ml，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；1 d 后更換一半的培養(yǎng)基，第3 天更換全部培養(yǎng)基，留下半貼壁細胞，第5 天再更換一半的培養(yǎng)基，第6 天收集所有的半貼壁細胞。

1.2.3 流式細胞術檢測DCs 表面分子CD40 和CD86 的表達

收集培養(yǎng)至第6 天的未成熟DCs，200×g 離心7 min，棄上清，計數(shù)后以5×105個/ml 的濃度接種于24 孔板中培養(yǎng)；分別加入不同劑量的WARCP 和CARCP 刺激DCs，陽性對照組加入100 ng/ml 脂多糖，陰性對照組加入RPMI-1640 培養(yǎng)基；刺激24 h 后收集細胞于離心管中，加入5 ml PBS 終止刺激，200×g離心7 min，棄上清；分別加入PE-CD11c、FITC-CD40和APC-CD86，常溫避光染色30 min；加入5 ml PBS終止染色，離心棄上清；用350 μl PBS 重懸細胞，經(jīng)200 目銅網(wǎng)過濾成單細胞懸液于流式管中，采用流式細胞儀檢測DCs 表面分子CD40 和CD86 的表達，F(xiàn)lowJo7.6 軟件處理流式細胞術檢測結果。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 5.01 統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料采用均值±標準差（Mean±SD）表示，組間比較采用t 檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 不同溫度下以粉末狀態(tài)儲存的WARCP 活性比較

將WARCP 粉末分別于4 ℃、-20 ℃和-80 ℃下儲存6 個月，然后溶于無菌PBS 中，以不同劑量的WARCP 刺激DCs，采用流式細胞術檢測DCs 表面分子CD40 和CD86 的表達。結果見圖1，3 個劑量組的WARCP 粉末均能促進DCs 的成熟，且具有劑量依賴性，但不同溫度下儲存的WARCP 粉末對DCs 表面分子CD40 和CD86 的表達均無明顯影響，其差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

圖1 不同溫度下以粉末狀態(tài)儲存的WARCP 對DCs 表面分子CD40 和CD86 表達的影響

2.2 不同溫度下以溶液狀態(tài)儲存的WARCP 活性比較

將WARCP 粉末溶于無菌PBS 中，配成質量濃度為10 mg/ml 的母液，分別于4 ℃、-20 ℃和-80 ℃下儲存6 個月，再以不同劑量刺激DCs，采用流式細胞術檢測DCs 表面分子CD40 和CD86 的表達。結果見圖2，3 個劑量組的WARCP 溶液對DCs 表面分子CD40 和CD86 的表達均無明顯影響，其差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.3 不同溫度下以粉末狀態(tài)儲存的CARCP 活性比較

將CARCP 粉末分別于4 ℃、-20 ℃和-80 ℃下儲存6 個月后以不同劑量刺激DCs，流式細胞檢測結果如圖3 所示，不同溫度下儲存的CARCP 粉末對DCs 表面分子CD40 和CD86 的表達均無明顯影響，其差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.4 不同溫度下以溶液狀態(tài)儲存的CARCP 活性比較

將CARCP 母液分別于4 ℃、-20 ℃、-80 ℃下儲存6 個月，再以不同劑量刺激DCs，流式細胞檢測如圖4 所示，當CARCP 劑量為10 μg/ml 時，于-20 ℃和-80 ℃下儲存的CARCP 溶液，其對應的DCs 表面分子CD40 表達均高于4 ℃下儲存的CARCP 溶液，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；當CARCP 劑量為50、100 μg/ml 時，儲存溫度對DCs 表面分子CD40 的表達無明顯影響，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。CD86 表達檢測結果表明，3 個劑量組的CARCP 溶液對DCs 表面分子CD86 的表達無明顯影響，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.5 相同溫度下儲存的WARCP 粉末和溶液活性比較

由圖5 可知，相同溫度下儲存的WARCP 粉末與溶液對DCs 表面分子CD40 和CD86 的表達無明顯影響，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.6 相同溫度下儲存的CARCP 粉末和溶液活性比較

圖2 不同溫度下以溶液狀態(tài)儲存的WARCP 對DCs 表面分子CD40 和CD86 表達的影響

圖3 不同溫度下以粉末狀態(tài)儲存的CARCP 對DCs 表面分子CD40 和CD86 表達的影響

由圖6 可知，相同溫度下儲存的CARCP 粉末和溶液對DCs 表面分子CD40 和CD86 的表達無明顯影響，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

3 討論與結論

中草藥提取物的活性受多種因素的影響，儲存溫度、儲存濃度、儲存時間、儲存狀態(tài)等均會改變其營養(yǎng)、保健和醫(yī)療等作用。文獻報道，馬齒莧多糖清除自由基的能力隨多糖濃度的升高而增強，隨儲存時間的延長和儲存溫度的升高而減弱，因此應在低溫條件下儲存以保持馬齒莧多糖的抗氧化活性[20]。此外，大棗多糖的儲存條件對其活性亦有很大影響，在3 種溫度下（室溫、4 ℃和-18 ℃）儲存大棗多糖，其抗氧化活性隨儲存時間的延長和儲存溫度的升高而降低，且在較低溫度（4 ℃和-18 ℃）儲存條件下抗氧化活性變化很小，由此得出結論低溫有利于大棗多糖抗氧化活性的保持[21]。

本研究結果顯示，WARCP 與CARCP 在低劑量10 μg/ml 時即可明顯刺激DCs 的成熟，且WARCP與CARCP 在100 μg/ml 時，與陰性對照組相比，CD40 比例分別上調52%和44%，CD86 比例分別上調32%和16%。文獻報道，車前子多糖在100 μg/ml 時CD40比例僅上調6.66%[22]；靈芝多糖在80 μg/ml 時CD86比例上調23.9%[9]，與本研究相當。上述結果表明，儲存6 個月后的WARCP 與CARCP 仍具有良好的免疫調節(jié)活性。本研究還探討了于不同溫度下儲存的WARCP 粉末或溶液對DCs 表面分子CD40 和CD86 表達的影響，結果發(fā)現(xiàn)不同儲存溫度下，無論是粉末狀態(tài)還是溶液狀態(tài)的WARCP，其對DCs 成熟的影響無明顯差異，表明儲存溫度和儲存狀態(tài)對WARCP 的免疫調節(jié)活性無影響或影響較小。同理本研究探討了儲存溫度和儲存狀態(tài)對CARCP 免疫調節(jié)活性的影響，結果發(fā)現(xiàn)僅在10 μg/ml 時，-20 ℃和-80 ℃儲存的CARCP 溶液活性優(yōu)于4 ℃儲存的CARCP 溶液，表明在使用低劑量的CARCP 時，低溫儲存其活性更優(yōu)。最后，本研究分析了在相同溫度下儲存的WARCP 與CARCP 粉末和溶液的活性比較，結果發(fā)現(xiàn)，以粉末狀態(tài)與溶液狀態(tài)儲存的WARCP 與CARCP 均能明顯促進DCs 的成熟，但兩種狀態(tài)下對DCs 的影響無明顯差異，表明在相同溫度下儲存狀態(tài)（粉末與溶液）對CARCP 的免疫調節(jié)活性無明顯影響。

圖4 不同溫度下以溶液狀態(tài)儲存的CARCP 對DCs 表面CD40 和CD86 表達的影響

圖5 相同溫度下儲存的WARCP 粉末和溶液對DCs 表面分子CD40 和CD86 表達的影響

圖6 相同溫度下儲存的CARCP 粉末和溶液對DCs 表面分子CD40 和CD86 表達的影響

綜上所述，粉末狀態(tài)的WARCP、CARCP 與溶液狀態(tài)的WARCP 分別于不同溫度下（4 ℃、-20 ℃和-80 ℃）儲存，其免疫調節(jié)活性差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；一定劑量的溶液狀態(tài)CARCP 分別于-20 ℃和-80 ℃下儲存，其免疫調節(jié)活性明顯優(yōu)于4 ℃下儲存（均P＜0.05）；相同溫度下儲存的WARCP與CARCP 的免疫調節(jié)活性均不受儲存狀態(tài)的影響（均P＞0.05）。本研究結果為保持新疆一枝蒿的免疫調節(jié)活性提供了保障，也為其作為免疫調節(jié)劑提供了重要的參考依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突