孫成相 丁志海

1天津醫(yī)科大學(xué)中新生態(tài)城醫(yī)院普外科300467；2天津海濱人民醫(yī)院普外科300280

0 引 言

據(jù)2018 年的數(shù)據(jù)，胃癌的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排名第5，死亡率位居第3，平均每12 位因惡性腫瘤而死亡的患者中就有1 例為胃癌患者[1]。世界上每年有數(shù)以百萬計的新發(fā)胃癌患者[1-2]。胃癌的發(fā)病率因地理位置和經(jīng)濟(jì)條件不同具有明顯的差異，東亞地區(qū)人群的胃癌發(fā)病率很高，我國平均100 000 人中就有20.7 例胃癌患者。胃癌嚴(yán)重威脅人們的生命健康[3]。因此，需要尋找與胃癌預(yù)后相關(guān)的靶點，針對可能預(yù)后不良的患者給予更早、更積極的治療。

肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C（myocyte enhancer factor 2C,MEF2C）位于人類5 號染色體5q14.3，是MADS轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子家族中的一員，其編碼的蛋白質(zhì)主要在肌生成中發(fā)揮作用。MEF2C 蛋白中具有DNA 結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄活性位點，能維持肌肉細(xì)胞的分化，該基因的突變會導(dǎo)致認(rèn)知障礙，運(yùn)動障礙和癲癇[4-8]。近些年的研究結(jié)果表明，MEF2C 在惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中也發(fā)揮重要作用。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

選擇2016 年1 月至2016 年12 月，天津醫(yī)科大學(xué)中新生態(tài)城醫(yī)院和天津海濱人民醫(yī)院收治的經(jīng)手術(shù)治療的胃癌患者66 例。其中，男性44 例，女性22 例，年齡（47.9±9.2）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：胃癌術(shù)后病理診斷明確，病理信息和實驗室檢查信息記錄完整；術(shù)前沒有經(jīng)過化學(xué)治療和放射治療；胃癌組織蠟塊標(biāo)本較多，足夠進(jìn)行重新切片和染色；術(shù)前無其他嚴(yán)重的基礎(chǔ)性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前接受過化學(xué)治療和放射治療。收集患者的腫瘤組織標(biāo)本和相應(yīng)的癌旁正常組織樣本，并于患者術(shù)后3 年內(nèi)進(jìn)行電話隨訪，記錄相關(guān)病情數(shù)據(jù)。所有患者均于術(shù)前簽署標(biāo)本可作為科研使用的知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要材料與儀器

免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），抗MEF2C 抗體（英國Abcam 公司），二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），蘇木素（北京索萊寶科技有限公司）。CX33 顯微鏡（日本奧林巴斯公司），RM2235型石蠟切片機(jī)（德國Leica 公司）。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測方法

將病理蠟塊切成4 μm 的白片平展于陽離子防脫玻片上，置于烘箱內(nèi)在70 ℃下處理30 min 后，立即放于二甲苯中脫蠟40 min（二甲苯，20 min；二甲苯，20 min），然后依次放入梯度乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)100%乙醇，10 min；100%乙醇，10 min；95%乙醇，10 min；75%乙醇，10 min）中進(jìn)行水化。將切片置于流動的自來水下沖洗10 min，徹底洗凈乙醇?xì)埩簟Ｇ衅?jīng)磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗后，置于枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液中，于微波爐中高溫煮沸，并持續(xù)沸騰10 min，打開蛋白質(zhì)相互交聯(lián)的高級結(jié)構(gòu)。將切片從微波爐中取出后，靜置冷涼至室溫，然后后加入體積分?jǐn)?shù)為3%的H2O2溶液，室溫孵育10 min，以滅活內(nèi)源性的過氧化物酶。于玻片上滴加牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液，置于37 ℃的濕盒中孵育30 min，封閉非特異性結(jié)合位點，然后甩去該溶液。PBS 清洗切片后，加入經(jīng)抗原稀釋液稀釋后的一抗（1∶100）覆蓋組織。切片置于濕盒內(nèi)密封，4 ℃孵育過夜。取出切片經(jīng)PBS 反復(fù)清洗后，加入二抗，放置于濕盒內(nèi)，室溫孵育1 h。PBS 清洗后，滴加配好的DAB 進(jìn)行顯色，所有切片控制顯色時間均為2 min。切片經(jīng)清洗后再加入蘇木素3 min 進(jìn)行細(xì)胞核復(fù)染，后經(jīng)鹽酸乙醇溶液分化，氨水返藍(lán)，自來水沖洗后，進(jìn)行梯度脫水（體積分?jǐn)?shù)75%乙醇，1 min；95%乙醇，1 min；無水乙醇，3 min；無水乙醇,3 min；二甲苯，5min；二甲苯，5 min）。中性樹膠封片后由病理醫(yī)師進(jìn)行蛋白表達(dá)量的評估。

1.2.3 臨床樣本生物信息學(xué)分析

通過基因表達(dá)譜交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA），在The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫中獲取臨床樣本619例，其中包括408 例胃癌組織樣本和211 例正常胃組織樣本。通過GEPIA 分析MEF2C 基因在胃癌組織和正常胃組織中的差異。以|log2FC|＞1，P＜0.01，抖動值0.4 為參數(shù)，進(jìn)行基因表達(dá)箱式圖的繪制。

從TCGA 數(shù)據(jù)庫中下載2 個胃癌隊列的RNA-seq數(shù)據(jù)和相關(guān)的患者信息，以MEF2C 的中位表達(dá)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，使用Kaplan-Meier 方法進(jìn)行總生存時間的分析，以Logrank 方法進(jìn)行統(tǒng)計檢驗。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

患者生存差異分析使用Logrank 方法進(jìn)行統(tǒng)計檢驗，兩組患者M(jìn)EF2C 的表達(dá)量與病理之間的相關(guān)性使用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果

基于TCGA 公共數(shù)據(jù)庫，通過GPEIA 分析MEF2C 的mRNA 在胃癌組織和正常胃組織中的表達(dá)情況，共分析胃癌組織408 例及正常胃組織211例。結(jié)果表明，MEF2C 的mRNA 在胃癌組織中顯著高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（圖1）。

圖1 胃癌組織中肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C 的mRNA 表達(dá)

為了進(jìn)一步研究MEF2C 的表達(dá)與胃癌患者長期預(yù)后的關(guān)系，從TCGA 數(shù)據(jù)庫中下載了2 個胃癌數(shù)據(jù)集，其中一個包含96 例胃癌組織標(biāo)本和96 例正常胃組織標(biāo)本，另一隊列包含288 例胃癌組織標(biāo)本和288 例正常胃組織標(biāo)本。利用Kaplan-Meier 分析了MEF2C 在胃癌患者預(yù)后中的作用。在兩個隊列中MEF2C 高表達(dá)的患者總生存時間較MEF2C低表達(dá)者短（圖2），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），提示胃癌中MEF2C 高表達(dá)的患者預(yù)后較差。

2.2 MEF2C 在胃癌組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，MEF2C 主要定位于細(xì)胞核中，胃癌組織中MEF2C 的表達(dá)異質(zhì)性較明顯，其中有22 例標(biāo)本中表達(dá)較低，44 例胃癌標(biāo)本中表達(dá)較高；癌旁的正常胃組織中，MEF2C 基本不表達(dá)。（圖3）

2.3 MEF2C 蛋白表達(dá)水平與胃癌患者的臨床病理特征的相關(guān)性

為了闡明MEF2C 在胃癌發(fā)生和進(jìn)展中的作用，分析比較了MEF2C 高表達(dá)組和MEF2C 低表達(dá)組患者的臨床病理特征差異，包括年齡、性別、腫瘤分級、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)，見表1。分析結(jié)果表明，66 例胃癌患者在年齡和性別分布上的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），可以保證數(shù)據(jù)的可比性。此外，MEF2C 的表達(dá)量和腫瘤分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移沒有明顯的相關(guān)性（均P＞0.05)。χ2檢驗結(jié)果表明，MEF2C 的表達(dá)量與患者手術(shù)時腫瘤大?。≒=0.022）和復(fù)發(fā)（P=0.015）的相關(guān)性有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論與結(jié)論

盡管胃癌相關(guān)的死亡人數(shù)在下降，但胃癌在世界范圍內(nèi)仍然是患者數(shù)最多的幾種癌癥之一[9-13]。胃癌給全球醫(yī)療造成了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)[10,12,14]。

圖2 肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C 表達(dá)與胃癌患者生存率的相關(guān)性

圖3 胃癌組織和癌旁正常組織中肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C 免疫組化結(jié)果

表1 肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C 蛋白表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

MEF2C 作為肌細(xì)胞增強(qiáng)因子中的一員，主要在肌肉細(xì)胞和心肌細(xì)胞中發(fā)揮作用，與肌肉細(xì)胞的生長、平滑肌的凋亡和癲癇等相關(guān)[15-19]。MEF2C 可作為多種蛋白發(fā)揮作用的中間載體，如大絲裂原活化蛋白激酶1（big mitogen-activated protein kinase 1,BMK1）。BMK1 為有絲分裂有關(guān)的蛋白，可以通過使MEF2C 387 位的絲氨酸殘基磷酸化發(fā)揮生物學(xué)功能，從而顯著增強(qiáng)MEF2C 的轉(zhuǎn)錄因子的活性，導(dǎo)致C-jun 基因轉(zhuǎn)錄的增加[20]。BMK1 作為MEF2C 的上游基因，與多種癌癥的侵襲及維持腫瘤細(xì)胞的干性相關(guān)[21-22]。另外，MEF2C 不僅參與了肌細(xì)胞相關(guān)的功能，它通過調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸的數(shù)量，在海馬依賴性的記憶和學(xué)習(xí)中也扮演著重要的角色，對于神經(jīng)皮層中正常的神經(jīng)發(fā)育至關(guān)重要[6,23-26]。在免疫系統(tǒng)中，MEF2C的表達(dá)量影響了B 細(xì)胞的增值和B 細(xì)胞抗原受體（B-cell receptor,BCR）的敏感程度，是生發(fā)中心B 細(xì)胞誘導(dǎo)和產(chǎn)生IgG1 抗體所必需的[27-30]。

MEF2C 在腫瘤中同樣發(fā)揮著重要作用。Sereno等[31]研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌的腦轉(zhuǎn)移過程中，MEFC2的表達(dá)量逐漸升高，參與了腦轉(zhuǎn)移過程。血液系統(tǒng)腫瘤中，Zhao 等[32]發(fā)現(xiàn)，MEF2C 的突變導(dǎo)致C-jun 表達(dá)增高，從而促進(jìn)彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤的進(jìn)展。Zhang 等[33]發(fā)現(xiàn)，MEF2C pre-mRNA 的可變剪切影響了正常肌細(xì)胞的活性，并促進(jìn)了橫紋肌肉瘤的發(fā)生。有研究者在研究乳腺癌腦轉(zhuǎn)移模型中，將小鼠乳腺癌細(xì)胞注射到頸動脈中，7 d 后在腦中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶，高通量測序發(fā)現(xiàn)，在腦轉(zhuǎn)移瘤和腫瘤周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，MEF2C 表達(dá)均上調(diào)。類似的結(jié)果在人乳腺癌患者切除的腦轉(zhuǎn)移瘤中也被發(fā)現(xiàn)，證實了MEF2C 在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮著作用[31]。Kang 等[34]的研究結(jié)果表明，MEF2C 參與了腫瘤細(xì)胞的耐藥，通過對5-氟尿嘧啶耐藥細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA-551a/MEF2C 軸在耐藥細(xì)胞系中顯著上調(diào)，參與了腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制。在一項對751 例小兒急性髓細(xì)胞白血病的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，MEF2C mRNA 高表達(dá)的患者在一個療程的化療結(jié)束后較其他患者的完全緩解率低，并且總生存情況也較差，復(fù)發(fā)風(fēng)險也更高。在小兒急性髓細(xì)胞白血病中，MEF2C 的高表達(dá)被認(rèn)為是不良預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。

本研究中，首先使用生物信息學(xué)的方法，分析了公共數(shù)據(jù)庫TCGA 中的胃癌和正常標(biāo)本中的MEF2C 的表達(dá)，結(jié)合生存分析，顯示MEF2C 高表達(dá)的胃癌患者預(yù)后更差，術(shù)后生存時間更短，提示MEF2C 與胃癌患者的預(yù)后相關(guān)。為了進(jìn)一步驗證該假設(shè)，本研究中分析66 例胃癌患者的病理和預(yù)后信息，對術(shù)后胃癌組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色分析，發(fā)現(xiàn)MEF2C 在胃癌組織中普遍高表達(dá)，而在正常胃組織中鮮有表達(dá)，而且MEF2C 高表達(dá)患者的腫瘤體積更大，術(shù)后更易復(fù)發(fā)。Zhang 等[35]的研究結(jié)果表明，MEF2C 在導(dǎo)管型胰腺癌中高表達(dá)，并且促進(jìn)了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，MEF2C 在胃癌組織中高表達(dá)，促進(jìn)了腫瘤的生長和復(fù)發(fā)，可以考慮將MEF2C 高表達(dá)作為胃癌預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突