梁錦峰，劉文華，鄢 宏，鄧少杰

(1. 深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院骨科中心，深圳 518100；2. 深圳市第二人民醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科，深圳518000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種自身免疫性骨關(guān)節(jié)炎，主要病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)滑膜腔炎性浸潤以及患者運(yùn)動功能受損，臨床癥狀表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫痛、關(guān)節(jié)畸形和行動不便。目前，臨床上治療RA的主要方向是減輕患者關(guān)節(jié)炎癥、改善患者骨侵蝕程度，這需要通過抑制滑膜細(xì)胞增殖、血管翳形成而實(shí)現(xiàn)[1]。RA發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但已有研究[2]證實(shí)一些炎性因子如白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等在RA發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）作為參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路之一，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖分化以及參與機(jī)體炎性反應(yīng)功能。研究[3]證實(shí)，ERK通路也參與了RA的發(fā)生和發(fā)展過程，RA的關(guān)節(jié)炎性浸潤病理改變與ERK通路存在緊密聯(lián)系，因此ERK通路在RA中的作用逐漸引起高度重視。川芎嗪（tetramethylpyrazine）是目前臨床中醫(yī)治療RA的一種常用藥物，臨床試驗(yàn)證實(shí)其具有抗炎、消腫和鎮(zhèn)痛之功效，可以有效緩解RA患者關(guān)節(jié)炎臨床癥狀。同時(shí)川芎嗪還具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新生血管生成的作用[4]，但川芎嗪治療RA是否通過干預(yù)ERK通路起效仍需要進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究通過建立膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠模型，觀察川芎嗪對關(guān)節(jié)炎模型大鼠病理學(xué)變化和體內(nèi)炎性因子水平的影響，探討和分析川芎嗪治療RA的起效機(jī)制以及對ERK通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器

30只SPF級雄性SD大鼠，（10.23±2.15）周齡，體質(zhì)量300~350 g，購自深圳康泰生物制品股份有限公司[SCXK（粵）2018-0193]。動物飼養(yǎng)于康美華大基因技術(shù)有限公司[SYXK（粵）2019-0 2 0 5]，動物實(shí)驗(yàn)倫理審批文號：醫(yī)科倫審-2018017。TNF-α、血管生成素1（Ang-1）、IL-1β和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）抗體試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；磷酸川芎嗪片購自廣州康和藥業(yè)有限公司（規(guī)格50 mg，國藥準(zhǔn)字H 4 4 0 2 4 2 7 2）；酶聯(lián)免疫吸附測定（E LI S A）試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和總RNA提取試劑盒購自美國賽默飛公司。

熒光定量PCR儀（型號 ABI 7500，美國賽默飛公司）；高速冷凍離心機(jī)（型號Mikro220R，德國Hettich公司）；電泳儀和電泳槽（型號分別為DYCZ、DYCP，中國北京六一儀器廠）；分光光度計(jì)（型號UV-2000, 美國安捷倫科技公司）；酶標(biāo)儀（型號E L3 0，美國B i o-T e k公司）；ELISA分析軟件（ReaderFit，中國杭州艾米綠公司）；96孔酶標(biāo)板（美國Costar公司）。

1.2 方法

將30只大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和川芎嗪組，每組各10只，采用文獻(xiàn)報(bào)道的膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎造模方法[5-6]：將20 mg雞Ⅱ型膠原充分溶解于10 mL濃度為0.1 mol/L的乙酸中，得到質(zhì)量濃度為2 g/L的雞Ⅱ型膠原，然后將等體積弗氏完全佐劑與該溶液混合并乳化完全得到乳化劑。造模成功后，川芎嗪組每日給予川芎嗪（0.1 g/kg）（其中磷酸川芎嗪片使用適量生理鹽水溶解，配制成灌胃混懸液），連續(xù)灌胃給藥28 d；模型組、正常組給予相同體積生理鹽水。每周測量3組大鼠后足體積變化情況，采取HE染色法觀察各組大鼠炎性細(xì)胞浸潤情況，采用ELISA法測定各組大鼠滑膜組織及血清中TNF-α、Ang-1、IL-1β、VEGF水平，另外采用蛋白質(zhì)印跡法檢測各組大鼠ERK1/2蛋白及磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白的表達(dá)水平。

1.3 觀察指標(biāo)及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度測定及比較 造模成功后，使用記號筆在大鼠足部踝骨關(guān)節(jié)突出位置作標(biāo)記，每周使用排水法[7]測量并記錄各組大鼠后足的體積大小，每只大鼠每次測定3次，取平均值。

1.3.2 各組大鼠組織病理學(xué)變化比較 于實(shí)驗(yàn)28 d脊椎脫臼法處死大鼠后，使用體積分?jǐn)?shù)10%的多聚甲醛溶液浸泡大鼠雙后肢膝關(guān)節(jié)1 d，然后使用體積分?jǐn)?shù)5%的硝酸溶液浸泡膝關(guān)節(jié)組織2周，浸泡至組織脫鈣完全且能夠順暢切斷骨質(zhì)后，重新使用體積分?jǐn)?shù)10%的多聚甲醛溶液浸泡，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片以及HE染色。

1.3.3 各組大鼠滑膜組織及血清中炎性因子水平測定 于實(shí)驗(yàn)28 d脊椎脫臼法處死大鼠前采集大鼠動脈血4 mL，離心后分離得到上層血清。另外，手術(shù)切取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，用ELISA試劑盒檢測所有樣本中TNF-α、IL-1β、Ang-1以及VEGF水平。嚴(yán)格按試劑盒操作說明檢測，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行樣品檢測。

1.3.4 滑膜組織各炎性因子mRNA表達(dá)測定 分別取各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織，用總RNA提取試劑盒提取組織中總RNA，使用紫外分光光度計(jì)測定總RNA濃度，樣品吸光度比值A(chǔ)260/A280≥1.80視為合格。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，分別得到模板單鏈cDNA，然后使用PCR試劑盒對cDNA進(jìn)行PCR。 PCR反應(yīng)條件為95 ℃30 s，退火60 ℃ 40 s，延伸72 ℃ 30 s；連續(xù)循環(huán)30次。然后采用2－△△Ct計(jì)算血清mRNA相對表達(dá)量[8]。

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡法測定ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平 剪取各組小鼠滑膜組織并加入裂解緩沖液，當(dāng)組織得到充分勻漿后將其靜置一段時(shí)間，然后放入離心機(jī)以12 000 r/min離心20 min，取出上清液后采用BCA法對ERK1/2、p-ERK1/2蛋白進(jìn)行定量測定。使用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳對蛋白樣品進(jìn)行分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，使用封閉液將樣品于室溫下封閉2 h。將膜轉(zhuǎn)入封閉液稀釋的一抗，4 ℃過夜后使用PBST沖洗液進(jìn)行洗滌，加二抗后繼續(xù)于室溫下孵育1 h，洗滌后采用電化學(xué)發(fā)光法檢測并進(jìn)行印跡成像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析不同組別各項(xiàng)指標(biāo)間差異，多組間采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠關(guān)節(jié)腫脹度

從第2周開始，模型組大鼠后足開始發(fā)生明顯腫脹，后足體積顯著大于川芎嗪組和對照組（P<0.0 5）（表1）。

2.2 大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)觀察

對照組大鼠關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整且關(guān)節(jié)面光滑，關(guān)節(jié)間隙大小正常，未顯示存在炎性浸潤和滑膜組織增生，關(guān)節(jié)兩端未發(fā)生骨侵蝕（圖1A）；模型組大鼠關(guān)節(jié)腔間隙比對照組顯著變大，且間隙中填充有滑膜增生組織，存在炎性浸潤和骨侵蝕現(xiàn)象，關(guān)節(jié)面和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)被破壞（圖1B）。川芎嗪組大鼠關(guān)節(jié)病理切片情況相比模型組有明顯好轉(zhuǎn)，關(guān)節(jié)面較清晰，關(guān)節(jié)間隙輕微增大，存在輕微炎性浸潤情況，但未發(fā)生明顯骨侵蝕，骨關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)比較完整（圖1 C）。

2.3 大鼠血清和滑膜組織中炎性因子水平

模型組和川芎嗪組大鼠血清和滑膜組織中炎性因子TNF-α、Ang-1、IL-1β表達(dá)水平比對照組大鼠均顯著升高（P＜0.05），同時(shí)川芎嗪組大鼠血清和滑膜組織中各炎性因子水平比模型組均降低（P＜0.05）。各組大鼠血清中均未檢測到VEGF，但模型組和川芎嗪組大鼠滑膜組織中VEGF水平均升高（P＜0.05），且川芎嗪組明顯低于模型組（P＜0.0 5）（表2）。

2.4 大鼠滑膜組織各炎性因子mRNA表達(dá)

與對照組相比，模型組和川芎嗪組大鼠滑膜組織中各炎性因子mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；川芎嗪組大鼠各炎性因子mRNA水平與模型組相比均顯著降低（P＜0.05）（表3）。

表 1 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度測定Table 1 Results of joints welling test in rats (-x± s)

圖 1 大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)觀察 （HE染色）Figure 1 Pathological observation on joint tissues in rats (HE staining)

2.5 大鼠滑膜組織ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)

與對照組比較，模型組和川芎嗪組大鼠滑膜組織p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.05），但川芎嗪組表達(dá)水平低于模型組（P＜0.05）；模型組和川芎嗪組大鼠ERK1/2蛋白表達(dá)水平與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表4）。

表 2 大鼠滑膜組織和血清中炎性因子水平Table 2 The levels of inflammatory factor levels in synovial tissue and serum of rats (-x ± s)

表 3 大鼠滑膜組織各炎性因子mRNA表達(dá)Table 3 The mRNA expressions of inflammatory factors in synovial tissues of rats (-x ± s)

表 4 大鼠滑膜組織ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平Table 4 The expressions of ERK1/2 and p-ERK1/2 proteins in synovial tissues of rats (-x ± s)

3 討論

膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠模型是一種慢性免疫炎性動物模型，已被學(xué)術(shù)界認(rèn)可作為研究RA發(fā)病機(jī)制的理想動物模型[9]。ERK作為與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和炎性反應(yīng)密切相關(guān)的信號通路，與RA的新生血管生成、細(xì)胞增殖分化、炎性浸潤以及蛋白酶表達(dá)等過程密切關(guān)聯(lián)，在RA整個(gè)發(fā)生和發(fā)展過程中活躍度很高[10]。TNF-α、IL-1β是促炎性Th1細(xì)胞分泌的一些重要炎性因子，其中IL-1β屬于炎性始動因子，高IL-1β水平會刺激軟骨細(xì)胞過度合成膠原酶以及致炎致痛物質(zhì)前列腺素E2，同時(shí)促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞聚集于關(guān)節(jié)滑膜，從而產(chǎn)生關(guān)節(jié)滑膜炎性反應(yīng)，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)發(fā)生降解[11]。TNF-α不僅可以誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，還能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生，以及導(dǎo)致軟骨受損[12]。在RA患者體內(nèi)Thl和Th2細(xì)胞處于失衡狀態(tài)，其中Th1細(xì)胞及其分泌的促炎細(xì)胞因子占據(jù)絕對優(yōu)勢。本研究發(fā)現(xiàn)RA模型大鼠血清中TNF-α、IL-1β等Th1促炎因子相比正常組大鼠明顯升高（P＜0.05）。有研究表明，VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶等一些與血管新生相關(guān)的細(xì)胞因子在RA患者血清和關(guān)節(jié)滑膜組織中也呈現(xiàn)明顯高表達(dá)，且與患者RA疾病嚴(yán)重程度存在顯著正相關(guān)性[13]。以上研究結(jié)果說明上述細(xì)胞因子共同參與了RA疾病的進(jìn)展，促進(jìn)新生血管生成、炎性浸潤以及骨侵蝕過程。

川芎嗪是從中藥材川芎中提取出來的一種活性成分，其藥理作用如抗新生血管生成、抑制細(xì)胞分化增殖和抑制炎性反應(yīng)等均已得到充分證實(shí)，且大量臨床研究和基礎(chǔ)研究證實(shí)川芎嗪可以緩解RA患者臨床癥狀[14]。本研究結(jié)果顯示，造模后第2周開始，模型組大鼠后足體積以及炎性因子TNF-α、Ang-1、IL-1β水平顯著大于或者高于對照組和川芎嗪組（P＜0.05）；且病理觀察顯示，模型組大鼠關(guān)節(jié)腔間隙存在炎性浸潤、滑膜增生組織和骨侵蝕現(xiàn)象，關(guān)節(jié)面和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)被破壞，而川芎嗪組大鼠關(guān)節(jié)間隙炎性損傷程度明顯低于模型組大鼠，未發(fā)生明顯骨侵蝕，骨關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)相對較完整，表明川芎嗪可降低炎性反應(yīng)，減輕后足炎性損傷。謝平金等[15]研究發(fā)現(xiàn)，使用川芎嗪對模型大鼠進(jìn)行干預(yù)后，大鼠血清IL-1β、TNF-α表達(dá)水平相對于模型組顯著降低（P＜0.05），證實(shí)川芎嗪在治療RA中發(fā)揮顯著抗炎作用。另外，本研究結(jié)果表明，模型組和川芎嗪組大鼠p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平相比對照組均顯著升高（P＜0.05），但川芎嗪組相比模型組顯著降低（P＜0.05），說明模型大鼠中p-ERK1/2蛋白存在過度表達(dá)，而川芎嗪可以通過抑制ERK信號通路促進(jìn)ERK1/2磷酸化即增加p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平。李巍等[16]研究表明，川芎嗪可以通過抑制滑膜組織ERK通路活化，有效降低膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎模型動物血清和滑膜組織中IL-1β、TNF-α和IL-12 炎性因子表達(dá)水平（P＜0.05），與本研究結(jié)果一致。王春亮等[17]研究發(fā)現(xiàn)，IL-l和TNF-α可以快速激活成纖維樣滑膜細(xì)胞中ERK、c-JUN氨基末端蛋白激酶和P38激酶活性，激活后的ERK和P38又會進(jìn)一步誘導(dǎo)IL-l和TNF-α等細(xì)胞因子表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致RA的發(fā)生發(fā)展。白菁安等[18]報(bào)道，川芎嗪治療RA的起效機(jī)制可能與抑制ERK通路活化過程存在密切聯(lián)系。結(jié)合本次研究結(jié)果，筆者認(rèn)為川芎嗪治療RA的起效機(jī)制可能是由于川芎嗪顯著減少炎性因子分泌，抑制機(jī)體淋巴細(xì)胞增殖，從而抑制ERK通路，降低ERK相關(guān)蛋白表達(dá)水平，最終有效改善大鼠關(guān)節(jié)腫脹癥狀，緩解關(guān)節(jié)組織的病理情況。

本研究采用的是經(jīng)典RA大鼠造模方法，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道驗(yàn)證，故研究中僅對造模組血清和滑膜組織炎性反應(yīng)進(jìn)行評估，就可以判斷造模成功。同時(shí)考慮到本研究主要目的是觀察川芎嗪對炎性因子和ERK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，因此著重關(guān)注川芎嗪組與模型組和空白對照組的比較，未設(shè)置陽性藥對照組，后續(xù)可進(jìn)一步完善。

綜上所述，川芎嗪可能通過有效抑制ERK通路，調(diào)節(jié)膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠血清和滑膜組織中TNF-α、IL-1β等炎性因子水平，緩解關(guān)節(jié)腫脹癥狀。