邸亞男，朱麗英，錢 雯，潘 衛(wèi),3,4

（1. 北京大學(xué)第三醫(yī)院北方院區(qū)檢驗(yàn)科，北京 100089；2. 貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；3. 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院貴州省產(chǎn)前診斷中心，貴陽(yáng) 550025；4. 貴州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025）

視力損害是危害人類健康的主要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，至2010年全球范圍內(nèi)大約有2.85億人伴有不同類型及程度的眼睛疾病，其中約有0.39億人失明[1]。視力損害的主要病因有屈光不正、白內(nèi)障、年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜變性和青光眼[2]。雖然眼睛疾病很少危及生命，但對(duì)個(gè)人、家庭及社會(huì)造成了巨大影響。因此，眼睛疾病的防治非常重要。然而，目前許多眼睛疾病的發(fā)病機(jī)制不明確，并且缺乏有效的治療方法。因此，能夠有效復(fù)制人類眼睛疾病且用于快速高通量藥物篩選的模式生物具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。

作為一種新興模式生物，斑馬魚（Zebrafish，Danio rerio）已經(jīng)被廣泛用于人類血液系統(tǒng)疾病、肌肉系統(tǒng)疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心臟疾病、腎臟疾病及眼睛疾病等的研究[3]。目前，斑馬魚信息網(wǎng)絡(luò)（zebrafish information network，ZFIN）已經(jīng)收錄了大量斑馬魚突變品系及轉(zhuǎn)基因品系的相關(guān)信息。由于斑馬魚在眼睛形態(tài)、解剖結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)及功能等方面與人類存在著極大的相似性，并且具有發(fā)育快、體外受精、胚胎透明、易于觀察等優(yōu)勢(shì)，因此其在眼睛發(fā)育及疾病的研究中具有重要意義。

隨著基因編輯技術(shù)、表型精細(xì)篩選技術(shù)、行為學(xué)觀察技術(shù)和基因及其功能鑒定技術(shù)的發(fā)展，斑馬魚作為模式動(dòng)物在眼睛疾病中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，已被用于眼睛缺損、青光眼、白內(nèi)障、視桿視錐細(xì)胞變性和糖尿病視網(wǎng)膜病變等眼睛疾病的研究[4]。除此之外，斑馬魚模型能夠?qū)崿F(xiàn)高通量和高效率的藥物篩選，可為篩選治療眼睛疾病的藥物提供良好的平臺(tái)[5]。本文對(duì)斑馬魚的生物學(xué)及基因組學(xué)特性、眼睛發(fā)育及結(jié)構(gòu)，以及作為研究眼睛疾病模型的優(yōu)缺點(diǎn)等進(jìn)行綜述。

1 斑馬魚的生物學(xué)及基因組學(xué)特性

斑馬魚屬鯉科熱帶淡水魚，原產(chǎn)于印度恒河流域。野生型斑馬魚體梭形，體側(cè)具有5～7條縱向暗藍(lán)與銀色相間條紋，為低溫低氧魚，耐寒性和耐熱性都很強(qiáng)。斑馬魚為雜食動(dòng)物，以浮游生物和昆蟲為食，人工喂養(yǎng)以蛋黃和輪蟲等為食，成魚可喂豐年蝦和紅蟲等。斑馬魚繁殖周期短，多為7 d左右，若溫度適宜，一年四季均產(chǎn)卵。雌雄魚交配行為受光照刺激，可通過(guò)調(diào)控光周期或控制雌雄魚的接觸，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)卵時(shí)間控制。每尾雌魚每次產(chǎn)卵可達(dá)200～300枚，為非黏性沉性卵，直徑大約0.7 mm，因其密度比水大而沉于缸底。卵細(xì)胞體外受精，體外發(fā)育且速度快，胚體透明[6]。魚卵受精后24 h，其主要器官已經(jīng)基本形成；3 d后幼魚逐漸從卵殼孵出，并開始游動(dòng)和覓食；大約3～4個(gè)月時(shí)，幼魚達(dá)到性成熟，可以繁殖后代[7]。斑馬魚生長(zhǎng)發(fā)育非?？?。成魚體長(zhǎng)約3～5 cm，壽命2～3年。

斑馬魚品系眾多，常用的主要是野生型Tuebingen品系、AB品系、WILK品系及多個(gè)突變品系和轉(zhuǎn)基因品系[8]。目前主要的斑馬魚保存機(jī)構(gòu)有國(guó)際斑馬魚資源中心 （Zebrafish International Resource Center，ZIRC）、中國(guó)斑馬魚資源中心（China Zebrafish Resource Center，CZRC）、依托于北京大學(xué)和清華大學(xué)的國(guó)家斑馬魚模式動(dòng)物北方中心，以及南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所-香港科技大學(xué)人類疾病斑馬魚模型研究聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室等。

斑馬魚有25條染色體，多為中間著絲?；蚨酥z粒。斑馬魚的全基因組約有1.5×109bp，堿基數(shù)量約為人類基因組的一半[7]。在英國(guó)Sanger研究所主持下，2001年開始了斑馬魚基因組測(cè)序，現(xiàn)轉(zhuǎn)由Genome Reference Consortium（GRC）主持。GRC在2014年9月發(fā)布了斑馬魚基因組最新版本 Zv10（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000002035.5/），且會(huì)不斷更新?；蜃⑨層?jì)劃提示，斑馬魚約有26 000個(gè)蛋白編碼基因[9]。人類70%的蛋白編碼基因在斑馬魚中有同源基因。但斑馬魚基因組也有一些與脊椎動(dòng)物不同的特性，如假基因較少、重復(fù)序列較多等[7]。由于在輻鰭魚進(jìn)化歷程中發(fā)生了硬骨魚類特異的全基因組復(fù)制事件（teleost-specific genome duplication，TSD），斑馬魚的蛋白編碼基因與人類蛋白編碼基因并不是一對(duì)一的關(guān)系，大多數(shù)人的基因在斑馬基因組中有兩個(gè)或多個(gè)拷貝[10]。例如，在人類基因組中，SRY 相關(guān) HMG盒轉(zhuǎn)錄因子11（SRY-related HMG-box transcription factor 11，SOX11）基因僅存在一個(gè)拷貝，而在斑馬魚基因組中則存在兩個(gè)拷貝：SOX11a和SOX11b[11]。因此，為了更好地利用斑馬魚這種模式生物，需要高質(zhì)量的斑馬魚基因組學(xué)信息，并且將其與人類基因組進(jìn)行差異分析。

2 斑馬魚的眼睛發(fā)育、結(jié)構(gòu)及功能

斑馬魚的發(fā)育非常迅速。根據(jù)斑馬魚在受精后3 d內(nèi)的發(fā)育形態(tài)學(xué)變化，可以將其發(fā)育過(guò)程分為8個(gè)大的時(shí)期，即受精卵期、分裂期、囊胚期、原腸胚期、體節(jié)期、咽裂期及孵化期和幼魚階段[12]。脊椎動(dòng)物的眼睛發(fā)育具有嚴(yán)格保守性。眼睛發(fā)育大致來(lái)源于3種胚胎組織。其中，視網(wǎng)膜、色素上皮、視柄及睫狀緣來(lái)源于神經(jīng)外胚層；晶狀體和角膜來(lái)源于皮膚外胚層；鞏膜和角膜的連接組織主要來(lái)源于神經(jīng)嵴起源的頭部間質(zhì)[13]。斑馬魚的眼睛發(fā)育順序也類似于大多數(shù)脊椎動(dòng)物。

斑馬魚眼睛發(fā)育的基本過(guò)程見圖1。約在10 hpf （hours post fertilization，受精后小時(shí)數(shù)）左右，受精卵第一個(gè)體節(jié)形成，胚胎發(fā)育進(jìn)入體節(jié)期。此時(shí)期的胚胎中，包括視原基在內(nèi)的各個(gè)器官原基相繼形成；該期持續(xù)到24 hpf，大部分器官基本成型，但尚未有功能[12]。視原基起源于前腦的神經(jīng)龍骨突，于神經(jīng)龍骨前部延長(zhǎng)形成“wing-like”結(jié)構(gòu)，“wing-like”結(jié)構(gòu)通過(guò)視柄與前腦相連。約15 hpf時(shí)，神經(jīng)視網(wǎng)膜與色素上皮開始出現(xiàn)；約16 hpf時(shí)，晶狀體基板開始形成；約24 hpf時(shí)，“wing-like”結(jié)構(gòu)旋轉(zhuǎn)并內(nèi)陷形成視杯，玻璃體動(dòng)脈通過(guò)成形的脈絡(luò)膜裂進(jìn)入視杯。在30 hpf時(shí)，角膜上皮形成于外胚層表面，并覆蓋晶體[14]；36 hpf時(shí)，視杯嵌入腦部，脈絡(luò)膜裂開始閉合，基質(zhì)細(xì)胞和韌帶覆蓋脈絡(luò)膜；48 hpf時(shí)，脈絡(luò)膜裂完全閉合，視神經(jīng)延伸至視頂蓋；50 hpf時(shí)，內(nèi)核層的無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞和水平細(xì)胞開始出現(xiàn)；55 hpf時(shí)，外核層視桿和視錐細(xì)胞外節(jié)形成；60 hpf時(shí)，雙極細(xì)胞出現(xiàn)[15]；約72 hpf時(shí)，斑馬魚幼魚具有視覺(jué)功能，同時(shí)眼周圍的肌肉發(fā)育成熟并具有功能，這是斑馬魚具有視動(dòng)功能的先決條件[16]。

圖 1 斑馬魚眼睛發(fā)育過(guò)程示意圖Figure 1 Schematic diagram of eye development in zebrafish

與哺乳動(dòng)物不同的是，在某種程度上可以說(shuō)，斑馬魚的視網(wǎng)膜從不會(huì)停止發(fā)育，成熟斑馬魚的視網(wǎng)膜仍然在增殖。所有類型的視網(wǎng)膜細(xì)胞都不斷地從睫狀緣的周圍生發(fā)中心產(chǎn)生。另外，視錐細(xì)胞也不斷地由視錐祖細(xì)胞生成。位于內(nèi)核層的Müller神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可以在視網(wǎng)膜受損傷時(shí)，修復(fù)產(chǎn)生所有類型的視網(wǎng)膜細(xì)胞[17]。另外，嚙齒類動(dòng)物體內(nèi)存在抑制性因子，而缺乏促生長(zhǎng)因子，其視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突不可再生；與之不同的是，斑馬魚體內(nèi)存在大量促生長(zhǎng)因子，其神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突可再生，從而恢復(fù)視功能[18]。

斑馬魚眼睛結(jié)構(gòu)與人類有很大相似性，但也有一定區(qū)別（表1，圖2），在應(yīng)用斑馬魚復(fù)制人類眼睛疾病時(shí)應(yīng)注意二者的差異。首先，人和斑馬魚的眼睛形狀與位置不同。人眼睛為圓形，而斑馬魚眼睛為橢圓形，因而斑馬魚的玻璃體較少。人眼睛位于頭面部前方，雙眼視覺(jué)高度交叉；而斑馬魚眼睛位于頭兩側(cè)，雙眼視覺(jué)交叉甚小[19]。其次，人和斑馬魚的視網(wǎng)膜各層厚度不一樣。斑馬魚視網(wǎng)膜由6種神經(jīng)元細(xì)胞和Müller神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成。與人類視網(wǎng)膜相似，斑馬魚視網(wǎng)膜由內(nèi)向外分為5層（圖2A和2B）：神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層（包含雙極細(xì)胞、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的突觸連接[20]）、內(nèi)核層（包含雙極細(xì)胞、無(wú)長(zhǎng)突神經(jīng)細(xì)胞、水平細(xì)胞胞體和Müller神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)[20]）、外叢狀層（包含感光細(xì)胞與雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞的突觸連接）和外核層（包含感光細(xì)胞：視錐和視桿細(xì)胞）[14,16,20]。

表 1 人類眼睛和斑馬魚眼睛的差異Table 1 Differences between human eyes and zebrafish eyes

另外，斑馬魚神經(jīng)節(jié)細(xì)胞都是有髓鞘的，而人類神經(jīng)節(jié)細(xì)胞視網(wǎng)膜部分的突觸是脫髓鞘的，只有視神經(jīng)部分有髓鞘。視網(wǎng)膜在視覺(jué)形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。外界光線投射到眼球表面，經(jīng)過(guò)屈光介質(zhì)到達(dá)視網(wǎng)膜，并被視網(wǎng)膜上感光細(xì)胞捕獲，將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為化學(xué)信號(hào)，再通過(guò)雙極細(xì)胞傳遞至視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，最后經(jīng)視神經(jīng)通路投射到大腦皮層（感光細(xì)胞—雙極細(xì)胞—神經(jīng)節(jié)細(xì)胞）。除此之外，該轉(zhuǎn)化后的化學(xué)信號(hào)還可以通過(guò)間接途徑，由雙極細(xì)胞傳遞給神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（感光細(xì)胞—水平細(xì)胞—雙極細(xì)胞—無(wú)突觸細(xì)胞—神經(jīng)節(jié)細(xì)胞）（圖2C）[21]。外核層外面有視網(wǎng)膜色素細(xì)胞上皮（r e t i n a l p i g m e n t e d epithelium，RPE）層包裹。RPE主要功能是為視網(wǎng)膜提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧化應(yīng)激調(diào)控和維持感光細(xì)胞外節(jié)的代謝。在發(fā)育過(guò)程中，RPE的缺陷可導(dǎo)致眼缺損、小眼畸形及無(wú)眼等眼睛疾病[13]。

斑馬魚的感光細(xì)胞即視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)與人類相似，由胞體和頂端域構(gòu)成。頂端域由一個(gè)近端內(nèi)節(jié)和一個(gè)遠(yuǎn)端外節(jié)構(gòu)成。其中，外節(jié)由膜盤堆積而成，包含能捕獲光量子的視蛋白。外節(jié)可脫落并更新，脫落的頂端被相鄰的RPE吞噬[13,22]。斑馬魚和人類均是晝行性動(dòng)物，其白天視力主要由視錐細(xì)胞控制。與夜行性嚙齒類動(dòng)物如小鼠和大鼠等不同，斑馬魚的視力幾乎全部由視錐細(xì)胞控制[23]。斑馬魚的視錐細(xì)胞分為4種，分別是短單（紫外線敏感）、長(zhǎng)單（藍(lán)光敏感）、長(zhǎng)雙（紅光敏感）和短雙（綠光敏感）（圖2 D）[20]。這4種視錐細(xì)胞以“馬賽克（mosaic）”模式排列，即成排分布的雙錐細(xì)胞和單錐細(xì)胞交替排列[24]。由于斑馬魚具有4種視錐細(xì)胞，所以可產(chǎn)生四色視覺(jué)；而人類缺乏紫外線-敏感視錐細(xì)胞，只有三色視覺(jué)[25-26]。斑馬魚的視桿細(xì)胞只有1種，并且以視紫紅質(zhì)為發(fā)色團(tuán)。另外，需要說(shuō)明的是，雖然斑馬魚的視網(wǎng)膜在5 dpf時(shí)形態(tài)學(xué)發(fā)育上已經(jīng)完善，但至少在15 dpf時(shí)才能發(fā)揮功能[23]。

眼前段結(jié)構(gòu)（角膜、晶體、虹膜、睫狀體和角膜虹膜角）是光線進(jìn)入眼睛到視網(wǎng)膜的途徑，對(duì)調(diào)節(jié)眼內(nèi)壓有重要作用。斑馬魚的眼前段結(jié)構(gòu)與高級(jí)脊椎動(dòng)物相似，但亦存在差異。斑馬魚的虹膜基質(zhì)缺乏肌細(xì)胞，不具有收縮能力，無(wú)環(huán)狀肌。與虹膜前部相連的部位被稱為睫狀區(qū)，而非睫狀“體”。睫狀上皮功能具有背腹差異，背側(cè)睫狀上皮主要是產(chǎn)生房水，而腹側(cè)則是房水排出通路[27]。斑馬魚的房水回流機(jī)制與人類亦存在差異。另外，斑馬魚的小梁網(wǎng)基質(zhì)組成及超微結(jié)構(gòu)也和人類有區(qū)別[28]。因此，在利用斑馬魚研究人類眼睛疾病時(shí)應(yīng)注意以上差異。

3 斑馬魚作為眼睛疾病模型的優(yōu)勢(shì)

3.1 斑馬魚作為模式生物的一般優(yōu)勢(shì)

自從遺傳學(xué)家George Streisinger將斑馬魚用于人工雌核的發(fā)育研究[3]后，斑馬魚作為模式生物逐漸引起了人們的極大關(guān)注。斑馬魚作為模式生物具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）體型小且價(jià)廉，適于大規(guī)模養(yǎng)殖；（2）產(chǎn)卵量大，發(fā)育快，生長(zhǎng)周期短，3～5個(gè)月性成熟即進(jìn)入繁殖期；（3）胚胎透明，體外受精和發(fā)育，易于觀察和操作；（4）斑馬魚基因組與人類基因組相似度很高，且其基因表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tags，ESTs）足夠多，已有約7萬(wàn)個(gè)ESTs被鑒定（http://danio.mgh.harvard.edu/chrMarkers/zfssr.html）；（5）斑馬魚可用于大規(guī)模藥物或化學(xué)分子的高通量篩選；（6）品系資源豐富；（7）精子可以冷凍保存[29]。

3.2 斑馬魚作為眼睛疾病模型的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)

斑馬魚在眼睛疾病研究中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。例如，其體型相對(duì)較小，但眼睛比較大，易于觀察和操作；眼睛發(fā)育快，72 hpf已具有功能。斑馬魚作為模式生物越來(lái)越多地用于眼睛和視力相關(guān)疾病的遺傳篩選和表型篩選。

傳統(tǒng)的遺傳篩選方法大致可分為正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)。正向遺傳學(xué)一般是通過(guò)生物體的自發(fā)突變或人工誘變，尋找表型遺傳的突變個(gè)體，從而找到對(duì)應(yīng)的突變基因，并揭示其功能。通過(guò)該方法往往可以找到新基因。目前，利用該技術(shù)已經(jīng)篩選并鑒定了影響眼睛和視力的相關(guān)疾病的大量基因[30]。人工誘變的方法有放射線導(dǎo)致基因缺失或突變，以及各種化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)基因發(fā)生點(diǎn)突變。常用的化學(xué)誘變劑有乙基亞硝基脲（ethylnitrosourca，ENU）。ENU通過(guò)對(duì)DNA堿基烷基化，誘導(dǎo)DNA復(fù)制時(shí)發(fā)生錯(cuò)配或堿基置換，產(chǎn)生單個(gè)核苷酸突變；其突變效率高，突變具有隨機(jī)性，無(wú)傾向性[31]。另外，用于正向遺傳篩選的策略包括反轉(zhuǎn)錄病毒或基因誘捕技術(shù)介導(dǎo)的大規(guī)模插入突變，這種策略也被相繼應(yīng)用到斑馬魚的基因突變研究中。Goss等[32]利用反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的插入突變技術(shù)篩選到了40個(gè)與視覺(jué)系統(tǒng)發(fā)育和功能有關(guān)的基因，如Cyclin A2、MCM2和NRR-1等。

反向遺傳學(xué)，即通過(guò)基因敲除或轉(zhuǎn)基因技術(shù)改變某個(gè)特定基因的功能，尋找有關(guān)的表型變化。用于斑馬魚反向遺傳學(xué)研究的有定向誘導(dǎo)基因組突變技術(shù)（targeting induced local lesions in g e n o m e s，T I L L I N G）、R N A干擾（R N A interference，RNA i）技術(shù)、反義寡核苷酸（morpholino，MO）、鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFN）技術(shù)、類轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）和成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其相關(guān)蛋白9（CRISPR-associated protein 9，Cas9）技術(shù)[30]。Lee等[33]利用MO技術(shù)敲低Bcl6a基因表達(dá)，引起斑馬魚眼睛缺損。CRISPR/Cas9作為新興的基因編輯技術(shù)，在反向遺傳學(xué)及基因治療方面也具有重大價(jià)值；目前該技術(shù)的應(yīng)用已擴(kuò)展到先天性白內(nèi)障、先天性青光眼、視網(wǎng)膜色素變性等遺傳性眼睛疾病的基因治療[34]。

事實(shí)上，目前有多個(gè)實(shí)驗(yàn)室和機(jī)構(gòu)在開展斑馬魚模式生物相關(guān)的基因突變研究工作（表2），如Sanger研究所資助的ZMP計(jì)劃（Zebrafish Mutation Project）、歐盟資助的ZF-HEALTH計(jì)劃（Zebrafish Regulomics for Human Health）、國(guó)際斑馬魚誘捕協(xié)會(huì)的多家實(shí)驗(yàn)室通過(guò)插入誘變獲得的突變庫(kù)（即zifishbook插入突變數(shù)據(jù)庫(kù)）等。另外，有一些網(wǎng)絡(luò)在線免費(fèi)工具可以用來(lái)搜尋和設(shè)計(jì)特定基因突變斑馬魚所需要的靶點(diǎn)，如ZIFIT（Zinc Finger Targeter，http://zifit.partners.org/ZiFiT/）可以用來(lái)搜尋和設(shè)計(jì)ZFN、TALEN和CRISPER等基因編輯技術(shù)所需的靶點(diǎn)序列，Mojo Hand（http://talendesign.com/mojohand.main.php）可以用來(lái)搜尋和設(shè)計(jì)TALEN所需的靶點(diǎn)序列。

表 2 斑馬魚基因突變研究計(jì)劃常用的突變技術(shù)和數(shù)據(jù)庫(kù)及網(wǎng)站鏈接Table 2 Mutation technologies, databases and website links of zebrafish gene mutation research programs

目前，斑馬魚的表型篩選主要是通過(guò)形態(tài)學(xué)、視覺(jué)行為學(xué)、成像系統(tǒng)及基因表達(dá)進(jìn)行的。從形態(tài)學(xué)觀察眼睛的大小、形狀與位置以及色素表達(dá)等是比較簡(jiǎn)單和直接的方法。斑馬魚可以通過(guò)周圍光線情況調(diào)節(jié)其色素表達(dá)，若其視覺(jué)有問(wèn)題而不能感受光線變化，則其色素表達(dá)量比正常多，利用這種特點(diǎn)可以進(jìn)行視覺(jué)損傷的篩選。另外，目前國(guó)際斑馬魚資源中心有大量標(biāo)記斑馬魚眼睛組織的抗體（http://zfin.org/action/antibody/search），可以用免疫組織化學(xué)法來(lái)進(jìn)行相應(yīng)抗原的檢測(cè)。斑馬魚行為學(xué)觀察是篩查其視力損害的有效方法，包括觀察視動(dòng)和眼動(dòng)行為學(xué)變化、驚恐反應(yīng)、逃避反應(yīng)、趨光反應(yīng)和背光反應(yīng)等[35]。但需要注意的是，行為學(xué)觀察法具有一定的局限性，例如肌肉損傷影響斑馬魚的運(yùn)動(dòng)功能時(shí)，可能會(huì)錯(cuò)誤地認(rèn)為是視覺(jué)損傷。因此，為了確保結(jié)果可靠性，可以應(yīng)用另外的方法來(lái)確證，如可以應(yīng)用視網(wǎng)膜電圖進(jìn)行視網(wǎng)膜功能的檢測(cè)[36]。

4 斑馬魚模型在眼睛疾病研究中的應(yīng)用

目前，斑馬魚已經(jīng)作為模式生物成功地應(yīng)用于多種眼睛疾病的研究中。Neuhauss等[37]利用視動(dòng)和眼動(dòng)視覺(jué)行為觀察了450尾基因突變斑馬魚，并從色素形成和組織形態(tài)等方面鑒定其眼睛損害，最后發(fā)現(xiàn)了多種引起視力損害的基因突變，包括晶體異常基因（SANDY）、軸突生長(zhǎng)異?；颍℅RUMPY、SLEEPY、PINSCHER）和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失基因（LAKRITZ）等。Gross等[32]對(duì)利用反轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)插入突變的250尾斑馬魚進(jìn)行了眼睛形態(tài)學(xué)及視覺(jué)行為學(xué)檢測(cè)，最后發(fā)現(xiàn)了40個(gè)引起眼睛發(fā)育異常和/或視覺(jué)功能損害的突變位點(diǎn)，如與早期眼睛發(fā)育形態(tài)有關(guān)的NDR2，與感光細(xì)胞損傷有關(guān)的NRF1、IXL和PWI。另外，截至目前，已經(jīng)利用基因突變成功建立了先天性白內(nèi)障、青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病、老年黃斑變性及先天性眼球震顫等眼睛疾病的斑馬魚動(dòng)物模型[38]。例如，叉頭轉(zhuǎn)錄因子1基因主要表達(dá)在眼前段及眼周間質(zhì)細(xì)胞中，與眼前段的發(fā)育與形態(tài)維持有關(guān)，該基因的缺陷可以引起斑馬魚類似青光眼表型的病理改變，如虹膜、小梁網(wǎng)和角膜異常[39]。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白2基因突變可引起斑馬魚眼睛變大、眼壓升高及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量逐漸減少等類似青光眼病變[40]。與人眼睛疾病相關(guān)的斑馬魚模型及基因突變和誘導(dǎo)方式總結(jié)見表3。

5 總結(jié)

視力損害是全球范圍內(nèi)廣受關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，研究其病理機(jī)制及治療方法十分重要。由于斑馬魚的眼睛發(fā)育及形態(tài)結(jié)構(gòu)等與人類有相似性，并具有易于繁殖、生長(zhǎng)發(fā)育較快、眼睛較大、易于觀察等優(yōu)勢(shì)，斑馬魚成為了研究人類視力損傷的一種理想模式生物。同時(shí)也應(yīng)該注意到其與人類眼睛的差異，比如斑馬魚是四色視覺(jué)，而人類是三色視覺(jué)，從而在利用斑馬魚模型進(jìn)行人類眼睛疾病相關(guān)研究時(shí)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)更科學(xué)，得出結(jié)論更嚴(yán)謹(jǐn)。

表 3 與常見眼睛疾病相關(guān)的斑馬魚模型Table 3 Zebrafish models related to common eye diseases