范姝瓊 ， 鄭 莉

[1. 迪哲（上海）醫(yī)藥有限公司，上海 201203；2. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433]

原癌基因編碼蛋白人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）作為表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）家族成員之一，當(dāng)基因擴增或過表達(dá)時會形成同源二聚體，或與EGFR家族其他成員形成異源二聚體，激活下游細(xì)胞通路，影響細(xì)胞的生長與增殖等功能[1-2]。腫瘤分子標(biāo)志物存在于腫瘤組織中，當(dāng)機體發(fā)生癌變時，與之相對應(yīng)的癌因子會發(fā)生功能性的改變。因此，通過對腫瘤分子標(biāo)志物的檢測可以及早發(fā)現(xiàn)腫瘤患者，并監(jiān)測其臨床治療效果以及評估預(yù)后。腫瘤分子標(biāo)志物在細(xì)胞中的精準(zhǔn)定位及表達(dá)水平與分子靶向藥物的治療效果密切相關(guān)[3]。在早期藥物研發(fā)階段，通過腫瘤分子標(biāo)志物檢測和判讀，可以直接驗證靶向化合物的作用機制，分析化合物在動物模型中達(dá)到的藥效動力學(xué)，幫助了解藥效動力學(xué)和藥代動力學(xué)的相關(guān)性。磷酸化HER2（phospho-HER2，p-HER2）作為HER2抑制劑的直接作用靶點，是最直接最理想的藥效驗證靶向蛋白[4]。從技術(shù)手段角度來說，免疫組織化學(xué)方法方便、快捷、易于操作，醫(yī)院病理科以及中心實驗室都具備比較成熟的免疫組織化學(xué)檢測技術(shù)和實驗條件，易于推廣。

在實際科研和病理診斷工作中，冷凍切片在操作上相較于石蠟切片更快速，常用于短時限內(nèi)病理診斷與生物標(biāo)志物的檢測。但冷凍切片的組織形態(tài)與抗原穩(wěn)定性容易受外部因素的影響，例如切片溫度、不同的組織固定液和切片存儲條件等[5-6]。 相較于石蠟切片，多次制片更容易對冷凍組織造成不可逆的損失和損傷。本文通過對比不同的固定條件和存儲時間，觀察免疫組織化學(xué)染色過程中p-HER2的信號變化，探討針對p-HER2檢測過程中冷凍組織切片的最佳固定與保存條件。

1 材料與方法

1.1 動物模型

6～8周齡雌性BALB/c-nu/nu小鼠10只，體質(zhì)量為20～25 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司[SCXK（京）2016-0011]，飼養(yǎng)于迪哲（上海）醫(yī)藥有限公司動物實驗室[SYXK(滬)2018-0015]。實驗正式開始前，需將動物在新環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。選取p-HER2高表達(dá)的人源性乳腺癌細(xì)胞株BT474，通過腹部皮下注射的方法建立小鼠皮下移植瘤模型，建模成功率為60%（6/10）。本實驗符合迪哲（上海）醫(yī)藥有限公司動物倫理委員制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)（IACUC：

1804-ONM-02）。

1.2 試劑

抗p-HER2（6B12）抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，免疫組織化學(xué)檢測試劑盒購自瑞士Ventana Roche公司，冷凍包埋劑OCT購自美國Thermo公司，蘇木精購自美國Sigma公司，甲醛、無水乙醇和乙酸均購自國藥集團藥業(yè)股份有限公司。乙醇-乙酸-甲醛（AAF）混合固定液的配制：冰醋酸5 mL，37%甲醛溶液10 mL，無水乙醇85 mL。

1.3 儀器

冷凍切片機Leica CM3050S Motorized Cryostat和病理切片病理數(shù)字掃描系統(tǒng)Aperio ScanScope均購自德國Leica公司，全自動免疫組織化學(xué)染色儀Ventana Discovery XT購自瑞士Ventana Roche公司。

1.4 制片

接種后第5日起，每隔3 d用游標(biāo)卡尺測量移植瘤體的長徑（L）、短徑（W）1次，取平均值，按公式V＝1/2（L×W2）計算移植瘤平均體積。待裸小鼠BT474細(xì)胞皮下腫瘤生長至約300 mm3時處死小鼠，剝離腫瘤組織，用液氮速凍[7]，連續(xù)冰凍切片（厚度為5μm）。然后進(jìn)行最佳固定與保存條件的探索。

1.5 切片固定

實驗分3部分。（1）探索不同固定液對p-HER2免疫組織化學(xué)染色信號的影響：制作2組冷凍組織切片，分別用體積分?jǐn)?shù)10%的中性甲醛固定液和AAF固定液處理5 min，然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。（2）探索冷凍切片后不同時間點進(jìn)行甲醛溶液固定對p-HER2免疫組織化學(xué)染色信號的影響：冷凍制片后1、5、20和30 min后，用10%中性甲醛溶液固定5 min，然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。（3）探索冷凍切片固定后在超低溫保存條件下的抗原穩(wěn)定性：采用逆向計算實驗時間的方法，在不同時間制備冷凍組織切片；未染色的切片經(jīng)過固定后，置于－20 ℃冰箱內(nèi)存儲；切片分別經(jīng)過1周、4周和12周后，與新鮮制備的冷凍切片一同進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，并將所有切片的染色結(jié)果與新鮮切片染色結(jié)果進(jìn)行對比。

1.6 免疫組織化學(xué)染色

用全自動免疫組織化學(xué)染色儀進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測。在制作好的切片上滴加質(zhì)量濃度為3.4 μg/mL的兔抗人p-HER2（Tyr1221/1222）單克隆抗體，孵育20 min后，洗去一抗；再滴加即用型Ultra Map過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗試劑，孵育16 min，再用ChromoMap DAB進(jìn)行顯色。顯色完成的切片滴加蘇木精染液，再滴加藍(lán)化試劑進(jìn)行返藍(lán)，完成組織細(xì)胞核的對比染色程序。染色完成的切片在無水乙醇中清洗，然后置于自動封片機上封固。

1.7 結(jié)果判讀

免疫組織化學(xué)染色切片經(jīng)Aperio成像系統(tǒng)掃描歸檔，染色結(jié)果由病理醫(yī)師進(jìn)行觀察、對比，并截圖拍照。

2 結(jié)果

2.1 不同固定液對p-HER2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的影響

用10%中性甲醛固定液處理后，切片組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)清晰，p-HER2的免疫組織化學(xué)染色信號清晰可判讀（圖1A）。用AAF固定液處理后，雖然切片組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，但p-HER2的免疫組織化學(xué)染色信號強度相對較弱（圖1B）。

2.2 BT474腫瘤組織固定前抗原的穩(wěn)定性

BT474移植瘤組織在冷凍制片后5～20 min進(jìn)行甲醛溶液固定，組織黏附性好，染色過程中不易掉片，光學(xué)顯微鏡下顯示組織結(jié)構(gòu)與細(xì)胞形態(tài)清晰，p-HER2染色信號穩(wěn)定無差異（圖1C～E）。冷凍制片30 min后再行甲醛溶液固定的切片中，p-HER2染色信號開始下降。 冷凍組織制片后立即進(jìn)行甲醛溶液固定的切片在光學(xué)顯微鏡下顯示組織黏附性較差，在染色沖洗過程中容易掉片，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不夠清晰，p-HER2免疫組織化學(xué)信號彌散（圖1F）。

圖 1 冷凍組織切片中p-HER2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(DAB顯色)Figure 1 Immunohistochemistry staining result of phospho-human epidermal growth factor receptor 2 (p-HER2) in frozen sections (DAB coloring)

2.3 BT474腫瘤組織固定后抗原的穩(wěn)定性

利用全自動染色儀對新鮮及經(jīng)過長時間保存的冷凍組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示，未經(jīng)染色的冷凍組織切片經(jīng)過12周的存儲后，組織黏附性好，染色過程中沒有發(fā)生組織脫落的現(xiàn)象，且組織與細(xì)胞形態(tài)完整清晰；p-HER2免疫組織化學(xué)染色信號清晰，其信號強度與固定完當(dāng)日即行免疫組織化學(xué)染色的切片相比沒有明顯差異（圖2）。

圖 2 未染色的冷凍組織切片經(jīng)過不同時間保存后p-HER2免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果（DAB顯色）Figure 2 Immunohistochemistry staining result of phospho-human epidermal growth factor receptor 2 (p-HER2) in frozen sections stored for different time (A, 0 day;B, 1 week; C, 4 weeks; D, 12 weeks) (DAB coloring)

3 討論

免疫組織化學(xué)染色作為生物標(biāo)志物常用檢測方法，利用抗原抗體結(jié)合以及化學(xué)顯色反應(yīng)，反映組織細(xì)胞中的蛋白含量及分布情況。由于其方法相對簡單，因此普及率相當(dāng)高，在醫(yī)院內(nèi)常用于輔助患者明確病理診斷，從而提供依據(jù)幫助選擇合適的靶向治療方案，以及用于判斷患者的預(yù)后情況。在新藥研發(fā)的過程中，免疫組織化學(xué)染色方法也常用于確定藥物的作用機制，并分析藥代動力學(xué)與藥物效果的相關(guān)性。常規(guī)的免疫組織化學(xué)實驗采用經(jīng)甲醛溶液固定的石蠟組織切片，其優(yōu)點是樣品易于保存，而缺點是從樣品采集、充分固定到石蠟切片制備完成所需要的時間較長，而且在實驗過程中經(jīng)過固定的抗原需要先進(jìn)行抗原修復(fù)。而冷凍組織切片相較于石蠟組織切片而言，其制片非?？焖?，抗原保存完好，而且切片染色可以滿足病理診斷的要求；冷凍組織切片由于當(dāng)天即可完成免疫組織化學(xué)染色，可以幫助醫(yī)生與科研人員在盡可能短的時間內(nèi)得出結(jié)論，因此該方法在醫(yī)院臨床實踐以及科研工作中都具有一定的優(yōu)勢。

本實驗通過比較針對冷凍組織切片的不同固定條件與保存時長對免疫組織化學(xué)信號的影響，探索多組樣本量情況下冷凍組織制片操作與存儲中可靈活調(diào)整的時間段，優(yōu)化針對同一樣本多種生物標(biāo)志物檢測的制片規(guī)劃，減少多次制片引起的反復(fù)凍融而導(dǎo)致冷凍樣本遭受不可逆的形態(tài)損傷與抗原丟失問題。

醛類固定液會使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)[8]，而乙醇通過沉淀蛋白發(fā)揮固定作用，同時兼有脫水作用[9]，因此10%中性甲醛溶液與AAF混合溶液均是醫(yī)院與各科研院所廣泛使用的針對冰凍細(xì)胞與組織切片的固定試劑。經(jīng)過短時間的固定液處理，用10%中性甲醛溶液固定的冷凍切片中的細(xì)胞形態(tài)與免疫組織化學(xué)染色信號強度相比于用AAF混合溶液固定過的樣品更為清晰，更有利于研究者在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行判讀打分。

冷凍組織切片中未經(jīng)固定的磷酸化蛋白降解非常迅速。本實驗對p-HER2抗原的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在冷凍組織制片5～20 min采用10%中性甲醛溶液固定后，檢測到的p-HER2免疫組織化學(xué)染色信號強度與新鮮切片沒有明顯差異；而在冷凍制片經(jīng)過30 min后再進(jìn)行固定的切片中，檢測到的p-HER2免疫組織化學(xué)染色信號明顯減弱。本研究發(fā)現(xiàn)p-HER2在20 min內(nèi)擁有良好的抗原穩(wěn)定性，這為日常工作中大批量冷凍樣品制片提供了一定的靈活操作時間。

綜上所述，利用冰凍組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色的可操作性強，需要染色時間短，在提高工作效率的同時不影響染色結(jié)果的判讀，可以考慮將其作為常規(guī)石蠟切片染色方法的補充或者替代。然而，冷凍組織切片未經(jīng)固定即暴露于外界，不僅組織形態(tài)容易遭受損傷，組織抗原信號也會降解甚至消失。本研究發(fā)現(xiàn)，冷凍組織制片后5～20 min，經(jīng)過10%中性甲醛溶液充分固定后的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，p-HER2蛋白穩(wěn)定性較好，而且－20 ℃條件下保存3個月之內(nèi)仍可以較好保存其抗原性，這一發(fā)現(xiàn)對實際檢測工作具有一定的價值。