劉 文 徐晶晶 彭亞琴 胡 月 宋雅嫻 何國平 湯冬冬 汪 菁

羊水細(xì)胞染色體核型嵌合比例、類型、發(fā)生位置的不同對胎兒臨床表型的影響不可預(yù)知，如何精準(zhǔn)評估“嵌合體”，并對孕婦是否繼續(xù)妊娠提供準(zhǔn)確的遺傳咨詢，是目前臨床工作中的重點和難點問題[1-2]。染色體核型嵌合存在真性嵌合和假性嵌合2種可能，難以判斷，雖然真性、假性嵌合的診斷標(biāo)準(zhǔn)明確，但嵌合體診斷的靈敏度和準(zhǔn)確度仍有待提高。染色體核型分析是診斷染色體異常較為公認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是使用該方法診斷染色體嵌合體，依然存在漏診、誤診的可能，研究[3-4]認(rèn)為染色體核型分析提示嵌合的孕婦并不應(yīng)立即終止妊娠，建議使用其他檢測技術(shù)進(jìn)一步驗證。

近年來，隨著細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，尤其是基因組拷貝數(shù)變異測序技術(shù)(copy number variation sequencing，CNV-Seq)日益廣泛地應(yīng)用于產(chǎn)前診斷，已對胎兒染色體嵌合的靈敏、特異診斷起到了積極的作用。本研究擬通過回顧性分析穿刺羊水標(biāo)本雙線培養(yǎng)、制片、G帶核型分析及聯(lián)合應(yīng)用CNV-Seq技術(shù)進(jìn)行嵌合體診斷的準(zhǔn)確性，并進(jìn)一步明確不同產(chǎn)前診斷指標(biāo)異常孕婦羊水中染色體核型的嵌合情況，探討2項技術(shù)聯(lián)合在胎兒染色體嵌合體診斷中的臨床應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年1月至2019年9月在中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)前診斷中心行常規(guī)產(chǎn)前診斷的孕婦為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：單胎妊娠，無妊娠感染及其他合并癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：孕婦本人或配偶染色體異常，精神疾病患者。本研究共納入3 320位孕婦，年齡21～37歲，孕周18～24周，均簽署產(chǎn)前診斷(含CNV-Seq)知情同意書。其羊水標(biāo)本均通過羊膜腔穿刺術(shù)順利獲取，分別用于染色體核型分析和CNV-Seq。

1.2 方法

1.2.1 經(jīng)腹B超引導(dǎo)下羊膜腔穿刺術(shù) 采用21 G穿刺針連接注射器抽取1～2 mL孕婦羊水后棄去，以避免母體細(xì)胞污染，改換注射器繼續(xù)抽取清亮羊水約25 mL，按順序分裝至I、II、III號管，I、III號管分別留取約10 mL羊水用于細(xì)胞培養(yǎng)，II號管留取約5 mL羊水用于CNV-Seq。

1.2.2 羊水核型分析 ①培養(yǎng)、制片：I、III號管分兩線獨立操作，分別接種后第2天加液2 mL，1周換液，顯微鏡下監(jiān)測細(xì)胞生長狀態(tài)，8～10 d后使用原位法收獲細(xì)胞并制片，G顯帶染色后，使用徠卡GSL-120自動掃描儀記錄信息。②閱片分析：兩線分別計數(shù)不少于15個細(xì)胞、分析不少于3個細(xì)胞，觀察、記錄染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)情況。按照國家衛(wèi)生健康委員會制定的羊水細(xì)胞嵌合體真實性評估及處理規(guī)則[5]，必要時擴(kuò)大細(xì)胞計數(shù)并增加核型分析數(shù)量。

1.2.3 CNV-Seq檢測 將II號管羊水標(biāo)本離心沉淀后，提取50 ng基因組DNA作為模板構(gòu)建測序文庫，使用BGISEQ-500測序儀進(jìn)行低深度高通量測序，記錄染色體非整倍體變異及100 kb以上的CNV并進(jìn)行分析。CNV結(jié)果的臨床評價基于美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(American College of Medical Genetics，ACMG)指南，突變命名參考國際系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)[6-7]。

1.3 隨訪 對羊水核型或CNV-Seq檢測結(jié)果提示為胎兒染色體嵌合體的孕婦提供遺傳咨詢，并對活產(chǎn)胎兒進(jìn)行隨訪。

2 結(jié)果

2.1 胎兒染色體嵌合體檢出率 3 320例羊水標(biāo)本中，CNV-Seq聯(lián)合G帶核型分析共檢測出胎兒染色體嵌合體19例(嵌合檢出率為0.57%)，其中核型檢測出16例(嵌合檢出率為0.48%)，CNV-Seq檢測出12例(嵌合檢出率為0.36%)。2種方法均檢測出的嵌合體共有9例，值得注意的是，3例核型分析未嵌合的標(biāo)本，CNV-Seq檢測出嵌合，后經(jīng)熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)驗證為真嵌合。見表1。

表1 核型分析和CNV-Seq嵌合結(jié)果

2.2 不同產(chǎn)前診斷指征孕婦羊水染色體嵌合結(jié)果 在不同產(chǎn)前診斷指標(biāo)異常的孕婦羊水標(biāo)本中，無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(non invasive prenatal testing, NIPT)提示異常的孕婦羊水中檢出嵌合體8例，超聲、胎兒頸項透明膜(nuchal translucecy, NT)厚度提示異常的孕婦羊水標(biāo)本中檢出嵌合體5例，高齡孕婦羊水標(biāo)本中檢出嵌合體2例，唐氏篩查結(jié)果提示高風(fēng)險的孕婦羊水標(biāo)本中檢出嵌合體4例。見表2。

表2 核型分析及CNV-Seq檢測不同產(chǎn)前診斷指征孕婦羊水染色體嵌合結(jié)果(例)

2.3 胎兒染色體異常嵌合類型 核型分析聯(lián)合CNV-Seq檢測為嵌合體的病例中，性染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常9例，常染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)異常的分別為9例和1例。其中有3例性染色體和7例常染色體異常嵌合的病例，核型分析與CNV-Seq檢測結(jié)果不一致。見表3。

表3 核型分析及CNV-Seq檢測出的異常嵌合類型(例)

3 討論

準(zhǔn)確鑒別胎兒染色體是否存在嵌合體以及嵌合的性質(zhì)，對決定孕婦的妊娠結(jié)局尤為關(guān)鍵。嵌合體的形成原因多種多樣，例如：在合子卵裂過程中或胚胎早期體細(xì)胞突變，此時每一條染色體都可能畸變，形成染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)異常的真性嵌合體。然而，特定情況下，多種因素也會導(dǎo)致假性嵌合現(xiàn)象，假性嵌合需通過進(jìn)一步檢測來確認(rèn)[8]。有學(xué)者提出在妊娠早期絨毛膜或中期羊水中若發(fā)現(xiàn)嵌合，不應(yīng)立即終止妊娠，應(yīng)行臍血穿刺術(shù)或羊膜腔穿刺術(shù)，并使用其他檢測技術(shù)進(jìn)一步證實胎兒染色體異常，例如：結(jié)合超聲診斷技術(shù)對胎兒進(jìn)行觀察，并考慮運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩查產(chǎn)前診斷生物標(biāo)志物[9]，如選擇繼續(xù)妊娠并活產(chǎn)胎兒，在胎兒出生后還應(yīng)檢測多個組織、加強(qiáng)隨訪[10]。

染色體核型分析是診斷染色體異常較為公認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是診斷低比例染色體嵌合體，以及在區(qū)分真性、假性嵌合過程中仍然存在明顯不足，迫切需要其他檢測方法的聯(lián)用，輔助診斷胎兒染色體嵌合體，以期更加準(zhǔn)確地區(qū)分真、假嵌合，實現(xiàn)靈敏、特異診斷[3]。

CNV-Seq是一項近年來興起的高通量測序技術(shù)，具有操作簡單、周期短、通量高、檢測范圍廣等優(yōu)勢，彌補(bǔ)了核型分析染色體結(jié)構(gòu)性變異分辨率大于10 Mb的不足[11-12]。CNV-Seq可以在分子水平上檢測出形態(tài)學(xué)觀察不易發(fā)現(xiàn)的染色體微缺失、微重復(fù)，還可以輔助檢測嵌合比例，發(fā)現(xiàn)核型分析無法診斷的低比例嵌合，同時避免取材誤差或體外培養(yǎng)、收獲、制片等人為操作造成的假性嵌合診斷，從而能夠更準(zhǔn)確地輔助臨床進(jìn)行遺傳咨詢[13]。

本研究采用的嵌合體檢測方案是穿刺羊水標(biāo)本行染色體G帶核型分析聯(lián)合CNV-Seq分子檢測，結(jié)果顯示核型分析胎兒染色體嵌合檢出率為0.48%，CNV-Seq嵌合檢出率為0.36%，2種方法聯(lián)用的嵌合檢出率為0.57%，CNV-Seq聯(lián)合核型分析提高了胎兒染色體嵌合體診斷的陽性檢出率，與既往文獻(xiàn)[14]報道的羊水嵌合體檢出率(0.3%)基本吻合。值得注意的是，3例核型分析無明顯嵌合的標(biāo)本，CNV-Seq檢測出真性嵌合，由此可見，穿刺取材、細(xì)胞培養(yǎng)、制片等實驗操作及人工分析引起的系統(tǒng)誤差，導(dǎo)致核型分析出現(xiàn)漏檢不可避免，而CNV-Seq作為輔助檢測手段，可以較好地彌補(bǔ)核型分析的劣勢[15-16]。在檢出嵌合體的病例中，對應(yīng)的產(chǎn)前診斷指標(biāo)異常包括：NIPT異常、超聲或NT厚度異常、孕婦高齡及唐氏篩查高危等，表明隨著分子遺傳學(xué)的快速發(fā)展、超聲診斷學(xué)的不斷進(jìn)步，常規(guī)產(chǎn)前檢查一定程度上提高了胎兒染色體嵌合體的陽性檢出率。此外，在檢出的10例染色體嵌合體中，核型分析與CNV-Seq檢測結(jié)果不一致，可能的原因是核型分析的是經(jīng)過體外培養(yǎng)的羊水細(xì)胞，而CNV-Seq檢測的是未經(jīng)體外培養(yǎng)的羊水細(xì)胞，且二者對于低比例嵌合的檢測靈敏度不同。

CNV-Seq雖然可以提高羊水穿刺產(chǎn)前診斷中胎兒嵌合體的診斷率，但由于其技術(shù)局限性，目前尚無法判斷遺傳物質(zhì)總量不變的情況下染色體結(jié)構(gòu)異常，如上述1例羅氏易位嵌合，CNV-Seq尚無法辨別。此外，在性染色體嵌合病例中，CNV-Seq雖能檢測到異常，但對結(jié)果更精準(zhǔn)的解讀尚需聯(lián)合核型分析。

綜上所述，對于NIPT、超聲[17-19]等產(chǎn)前篩查中發(fā)現(xiàn)的高危妊娠，CNV-Seq聯(lián)合常規(guī)G帶染色體核型分析可以彌補(bǔ)單一檢測方法診斷羊水穿刺胎兒染色體嵌合體出現(xiàn)誤診的不足，，且有助于發(fā)現(xiàn)染色體低比例嵌合及微缺失、微重復(fù)，為產(chǎn)前遺傳咨詢提供了更加可靠的實驗室診斷結(jié)果。