王帥珂 呂英杰 張?jiān)蛮i 丁 壯 韓 軍 郭尚敬 陳 芳

(1.聊城大學(xué) 藥學(xué)院，山東 聊城 252059； 2.聊城大學(xué) 生物制藥研究院，山東 聊城 252059；3.聊城大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252059)

蒲公英(Taraxacumofficinale)屬菊科，多年生草本植物，廣泛分布于北半球，作為中國(guó)傳統(tǒng)中藥材之一在治療疾病方面已有上千年歷史[1,2]，并且蒲公英能夠發(fā)揮不同的藥理作用，如抗癌、抗風(fēng)濕、清熱解毒、抗菌、抗糖尿病以及抗炎特性等[3-5].現(xiàn)代研究表明，原始蒲公英的治療效果要?dú)w因于生物活性成分，包括多糖類(lèi)、生育酚類(lèi)、肉桂酸衍生物、黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)化合物和維生素B2等[6-8].在上述物質(zhì)中，多糖已被證明是具有多種藥理學(xué)功能的主要活性成分之一，例如從普通的蒲公英地上部分分離出的多糖具有保護(hù)肝臟的作用[9].從蒲公英根部提取的多糖能夠抑制對(duì)乙酰氨基酚(APAP)所誘導(dǎo)的肝臟氧化損傷[10].此外，從蒲公英葉子中提取的多糖作為抗炎和抗氧化劑能夠發(fā)揮有效的藥理作用[11].

魚(yú)腥草(Houttuyniacordata)屬三白草科，主要產(chǎn)于云貴川以及南方地域.味辛，性微寒，具有清熱解毒、利尿通淋、抗病毒等作用[12].魚(yú)腥草的抗病毒[13]、抗炎[14]、抗菌[15]、抗增殖活性[16]已被許多研究證實(shí).魚(yú)腥草作為一種傳統(tǒng)治療肺炎的中草藥，其主要活性成分為多糖類(lèi)物質(zhì)[17].從魚(yú)腥草全草中提取的魚(yú)腥草多糖可以減輕急性肺炎損傷并且能夠通過(guò)抑制TLR4通路和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，改善H1N1感染引起的肺部炎癥[18-21].

現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道中，對(duì)蒲公英和魚(yú)腥草多糖類(lèi)物質(zhì)的研究多為體外抗炎、細(xì)胞抗病毒以及多糖提取工藝等研究，鮮見(jiàn)多糖類(lèi)物質(zhì)對(duì)動(dòng)物腸炎恢復(fù)及對(duì)肝腎功能影響的報(bào)道.因此本研究探索了蒲公英和魚(yú)腥草粗多糖對(duì)小鼠腸炎及肝腎功能的影響，分別對(duì)兩種不同的革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌做了體外抑菌實(shí)驗(yàn)；并通過(guò)葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)小鼠腸炎，分別觀(guān)察并分析兩種粗多糖對(duì)小鼠腸炎的恢復(fù)效果，以及反映肝腎代謝功能的天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、肌酐(Cr)和尿素氮(Bun)的酶活性變化，闡明蒲公英和魚(yú)腥草兩種粗多糖對(duì)腸炎恢復(fù)及肝腎保護(hù)功能，為今后蒲公英和魚(yú)腥草多糖的臨床應(yīng)用提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蒲公英提取物10∶1(西安瑞林生物科技有限公司)、魚(yú)腥草提取物10∶1(西安瑞林生物科技有限公司)、蒲公英和魚(yú)腥草粗多糖溶液.

實(shí)驗(yàn)菌株：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis CMCC 63051)，大腸桿菌(Escherichia coliCMCC 44102)，銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaCMCC10104)，金黃葡萄球菌(StaphylococcusauresCMCC26003)

1.2 主要試劑與儀器

苯酚AR(煙臺(tái)遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司)；硫酸AR(煙臺(tái)遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司)；氯仿AR(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；正丁醇AR(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；丙酮AR(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；葡萄糖AR(天津大茂化學(xué)試劑有限公司)；纖維素酶10000 U/g(南寧東恒華道生物科技有限公司)；氨芐青霉素(Amp)、葡聚糖硫酸銨鹽(dextran sulfate sodium，DSS，都萊生物科技有有限公司，MW：40000，Assay：≥98.0%)，肝腎酶活測(cè)定試劑盒(南京建成生物科技有限公司)、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、離心機(jī)(eppendorf)、灌胃針、酶標(biāo)儀(BIOTEK)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A(上海亞榮生化儀器廠(chǎng))；凈水系統(tǒng)Milli-Q Advantage S.Kit(USA)；超低溫冰箱MDF U53V(日本三洋).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 粗多糖制備方法. (1) 樣品液的制備，分別稱(chēng)取5 g蒲公英和魚(yú)腥草提取物粉末，按照1∶20的料液比加入去離子水100 mL，調(diào)節(jié)pH至5.0±0.05，再加入10000 U/g的纖維素酶，使?jié)舛群靠刂圃?%，然后將混合物置于超聲水浴槽中50 ℃超聲處理40 min.旋蒸儀濃縮提取液，加入80%乙醇沉淀24 h.3000 rpm，5 min離心收集沉淀物，用無(wú)水乙醇和丙酮清洗2-3次，采用冷凍干燥的方法制備粗多糖.(2) 粗多糖脫蛋白處理，將以上步驟所獲得的粗多糖溶解于去離子水中，用氯仿-正丁醇(4∶1)處理進(jìn)行脫蛋白，重復(fù)4-5次；收集水相并濃縮至原體積的1/5，使用80%乙醇在4 ℃沉淀24 h.之后將上清液濃縮，透析48 h，祛除小分子物質(zhì)，收集透析袋中物質(zhì)冷凍干燥； (3) 粗多糖含量測(cè)定：采用苯酚-硫酸法測(cè)定粗多糖含量[22].首先制備5%的苯酚溶液，4 ℃冷藏備用；再配置葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg葡萄糖，于250 mL容量瓶中定容，使其濃度為0.04 g/L,分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL，加入到試管中，各自加入去離子水補(bǔ)至1.0 mL，在冰浴中先后加入5%苯酚0.5 mL和濃硫酸2.5 mL，搖勻冷卻以不放熱或微量放熱為宜，沸水浴中加熱20 min，涼水冷卻10 min，0 mL做空白對(duì)照調(diào)零，490 nm下測(cè)定吸光度，以葡萄糖濃度(g/L)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制回歸直線(xiàn).

1.3.2 粗多糖抑菌實(shí)驗(yàn)方法. (1) 菌株活化方法：用接種環(huán)將保存好的細(xì)菌菌株接種于滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，180 rpm，培養(yǎng)過(guò)夜.(2) 抑菌圈測(cè)定方法：制備1 mg/mL的氨芐青霉素100、50、25 g/L粗多糖溶液.采用濾紙片方法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，將經(jīng)過(guò)滅菌的LB固體培養(yǎng)基倒平板，靜置待其凝固；凝固后吸取100 mL的菌液進(jìn)行均勻涂布；每一處可以摞2-3層6 mm直徑濾紙片；向?yàn)V紙片表面加入10 mL藥液，陰性對(duì)照加入同樣體積的去離子水，陽(yáng)性對(duì)照則加入同等體積的羥氨芐青霉素， 37 ℃培養(yǎng)14-16 h觀(guān)察結(jié)果.

1.3.3 DSS誘導(dǎo)小鼠腸炎模型建立方法. (1) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：云南昆明鼠，雌性，48只，重量35 g，分為4組(空白對(duì)照組、自然恢復(fù)組、蒲公英組、魚(yú)腥草組)，每組4只，3次重復(fù).(2) 小鼠腸炎模型建立：精密稱(chēng)取0.5 g DSS，溶解到10 mL去離子水中，漩渦震蕩使其完全溶解，制得5%含量的DSS溶液；在建模前12 h小鼠應(yīng)當(dāng)禁食不禁水，參考給藥量為0.1-0.3 mL/10 g，最大不超過(guò)0.5 mL/10 g[23].連續(xù)7 d灌胃處理，每天灌胃1次，劑量為350 mL ；空白對(duì)照組灌胃相同體積的生理鹽水.DSS處理7 d后進(jìn)行粗多糖處理21 d，空白對(duì)照組灌胃等體積的生理鹽水.(3) 生理生化指標(biāo)測(cè)定：小鼠DSS處理后每天觀(guān)察記錄排便情況、糞便狀態(tài)、肛周污染情況、體毛發(fā)光澤變化等情況，每3天測(cè)量1次體重；

DSS處理后每7 d取血液樣品一次，取血方式采用眼球取血；血樣3500 rpm，離心10 min，分離上清即實(shí)驗(yàn)所需要的血清樣品；-80 ℃超低溫冰箱貯存.根據(jù)試劑盒(南京建成生物科技有限公司)的使用要求檢測(cè)血清中肝腎代謝相關(guān)酶AST、ALT、Cr和Bun的水平.

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量的測(cè)定

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的制備

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液不同體積吸光度

表2回歸方程參數(shù)

回歸方程參數(shù)數(shù)值R20.995方程Y=0.032X+0.063

圖2 蒲公英和魚(yú)腥草多糖凍干粉

將得的粗多糖稱(chēng)取0.015 g溶解到30 mL去離子水中，配制成0.5 μg/L母液，按照表1的操作方法，測(cè)量其吸光度并代入到對(duì)應(yīng)的回歸方程(圖1、表2)，算得每mL蒲公英粗多糖含糖量為76.1% ；魚(yú)腥草粗多糖含糖量為每mL粗多糖含糖量為73%，采用冷凍干燥法獲得粗多糖樣品(圖2).

2.2 體外抑菌效果分析

注：圖中A平板為蒲公英粗多糖處理，B平板為魚(yú)腥草多糖處理；圖中1為5 μg氨芐青霉素；2為500 μg粗

多糖；3為無(wú)菌水對(duì)照；4為250 μg粗多糖；5為125 μg粗多糖.

圖3蒲公英和魚(yú)腥草粗多糖體外抑菌效果

從圖3可知，三種不同濃度蒲公英粗多糖溶液對(duì)大腸桿菌均未有抑菌效果，而100 g/L和50 g/L的魚(yú)腥草粗多糖溶液對(duì)大腸桿菌有一定的抑菌效果，如圖3(1)；蒲公英粗多糖和魚(yú)腥草粗多糖溶液對(duì)枯草芽孢桿菌有明顯的抑菌效果，并且與1 g/L的Amp的抑菌效果相當(dāng)，如圖3(2)；兩種粗多糖溶液對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌均未有明顯抑菌作用，只有100 g/L的魚(yú)腥草粗多糖溶液對(duì)金黃色葡萄球菌有較小的透明圈，如圖3(3)、(4).

2.3 小鼠相關(guān)指標(biāo)觀(guān)察和測(cè)定

表3 小鼠相關(guān)指標(biāo)觀(guān)察和測(cè)定

由表3可知，建模完成一周后，自然恢復(fù)組、魚(yú)腥草組、蒲公英組的小鼠均出現(xiàn)腹瀉、肛周腫脹發(fā)紅、精神狀態(tài)欠佳、食欲下降，并且除空白對(duì)照組以外其它三組小鼠的糞便出現(xiàn)了量多、連結(jié)、粘稠、不定型等癥狀；經(jīng)過(guò)藥物處理第3 d和第4 d得到了較為明顯的改善，但仍舊有輕度腹瀉的癥狀，魚(yú)腥草組小鼠鼻孔還伴有輕微的出血的現(xiàn)象，具體原因有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析探討.

2.4 小鼠肝腎功能指標(biāo)分析

由圖4可知，實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)經(jīng)過(guò)DSS處理的自然恢復(fù)組AST酶活力值最高，空白對(duì)照組最低，蒲公英組和魚(yú)腥草組介于兩者之間.DSS處理第7 d AST 酶活力值與空白對(duì)照相比顯著升高，說(shuō)明DSS處理引起小鼠肝毒性使得AST酶活力值升高.DSS處理7 d后進(jìn)行蒲公英和魚(yú)腥草粗多糖灌胃處理3 w，經(jīng)蒲公英和魚(yú)腥草粗多糖處理7 d后，AST酶活力值與自然恢復(fù)組相比即出現(xiàn)顯著下降，粗多糖處理3 w后酶活力值逐漸降低并趨于正常值，因此蒲公英和魚(yú)腥草粗多糖處理顯著降低了AST酶活力，減輕了由DSS引起的小鼠肝毒性.

圖4 小鼠AST酶活力值

圖5 小鼠ALT酶活力值

經(jīng)過(guò)DSS處理的小鼠，自然恢復(fù)組小鼠的ALT值也是最高的，空白對(duì)照組最低，蒲公英組和魚(yú)腥草組介于兩者之間(圖5).DSS處理第7 d，自然恢復(fù)組ALT酶活力值與空白組相比顯著升高；經(jīng)粗多糖處理21 d后蒲公英組和魚(yú)腥草組小鼠ALT水平幾乎無(wú)差異，并且下降至空白組水平范圍；自然恢復(fù)組在DSS處理第21 d后ALT也出現(xiàn)了下降，但其水平仍明顯高于其它三組小鼠ALT水平.因此兩種粗多糖處理顯著降低ALT酶活力，降低了由DSS引起的小鼠肝毒性.

由圖6可知，經(jīng)過(guò)DSS處理，自然恢復(fù)組酶活力值上升最明顯并且酶活力值最高；隨后酶活力開(kāi)始下降；魚(yú)腥草組始終處于下降狀態(tài)，并且趨勢(shì)很穩(wěn)定，第7-28 d酶活力值變化不顯著，魚(yú)腥草組經(jīng)過(guò)粗多糖處理，其酶活力值在第14 d以后就低于空白組，考慮為魚(yú)腥草在改善Bun指標(biāo)的效果上要優(yōu)于蒲公英；蒲公英組酶活力值在第21 d和第28 d時(shí)下降到與空白對(duì)照組相當(dāng)水平.因此，兩種粗多糖可以有效降低Bun酶活力值并且對(duì)DSS小鼠的腎臟具有保護(hù)作用.

由圖7可知，模型組的酶活力值都明顯高于空白對(duì)照組；在模型組中，自然恢復(fù)組的酶活力值又高于蒲公英組和魚(yú)腥草組；魚(yú)腥草組和蒲公英組自DSS處理后第8 d開(kāi)始，酶活力值一直處于下降狀態(tài)，蒲公英組酶活力值一直低于魚(yú)腥草組，自然恢復(fù)組從第21 d起，酶活力值也開(kāi)始下降，但是仍舊高于其它三組值.因此，兩種粗多糖在降低Cr酶活力值方面起到了重要作用并且也能夠保護(hù)小鼠腎臟，降低由DSS引起的腎功能損傷.

圖6 小鼠Bun酶活力值

圖7 小鼠肌酐(Cr)酶活力值

3 結(jié)論

本研究采用超聲波-酶輔助方法對(duì)蒲公英和魚(yú)腥草進(jìn)行粗多糖的提取，提取率達(dá)5.22%-5.78%；采用酶標(biāo)儀檢測(cè)法，測(cè)出粗多糖含糖率達(dá)到了73%-76.1%；在此條件下又對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌進(jìn)行了抑菌實(shí)驗(yàn)，所得到的效果為魚(yú)腥草粗多糖的抑菌效果要優(yōu)于蒲公英多糖，并且100 g/L的蒲公英粗多糖和魚(yú)腥草粗多糖與1 g/L的Amp的抑菌效果相當(dāng)，在這四種菌中，枯草芽孢桿菌對(duì)粗多糖的敏感性最高，銅綠假單胞菌最不敏感.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，兩種粗多糖均能改善小鼠因DSS誘導(dǎo)腸炎而產(chǎn)生的體態(tài)不良反應(yīng)，并且也能夠從一定程度上緩解因DSS造成的肝腎功能損傷；同時(shí)也為實(shí)驗(yàn)下一步探究粗多糖對(duì)小鼠抗炎機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ).