張亞柯 黃玉嬌 李 英 崔 瀟 楊玉嬌 李 軍

(聊城大學 藥學院，山東 聊城 252059)

0 引言

免疫脂質體制劑作為靶向制劑的一種，具有精確靶向性、生物相容性好、毒性低、降低給藥劑量、避免耐藥性[1]和提高病人用藥順應性等優(yōu)點[2,3].CD20在95%以上的B淋巴細胞型的非霍奇金淋巴瘤中特異性高表達[4,5].羅氏公司研發(fā)的抗CD20單克隆抗體藥物美羅華(Rituximab，利妥昔單抗)上市以來，已經有多款以CD20為靶點的單克隆抗體藥物在全球范圍內上市或者處于研發(fā)管線[6]，用于復發(fā)的或化療抵抗性非霍奇金淋巴瘤[7,8].長春新堿作為常規(guī)聯合化療用藥，在臨床上廣泛用于非霍奇金淋巴瘤等癌癥治療[9,10].然而，由于長春新堿對腫瘤細胞和正常體細胞具有非特異性殺傷作用[11]，臨床上會引起周圍神經病(peripheral neuropathy)、低鈉血癥(Hyponatremia)等毒副作用[12].我們制備了長春新堿脂質體，并通過anti-CD20單克隆抗體免疫化修飾獲得了包裹長春新堿的免疫靶向脂質體制劑[13]，一系列體外實驗證實該制劑可以特異性靶向殺傷B細胞淋巴瘤細胞[14].

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

Raji和Ramos細胞(美國標準生物品收藏中心(ATCC));細胞培養(yǎng)基RPMI-1640、胎牛血清(Thermo Fisher Scientific-GIBCO公司，美國)；鞘磷脂、DSPE-PEG、Mal-PEG2000-DSPE(Avanti，美國)；膽固醇(Sigma公司)；50、100、200 nm孔徑聚碳酸酯膜(Whatman公司)；anti-CD20單克隆抗體(上海張江生物技術有限公司)；氯仿、無水乙醇等試劑(J.T.Baker公司)；Cell Counting Kit-8試劑盒(DOJINDO公司，日本)；硫酸長春新堿(Vincr istine，VCR)(大連美侖生物公司，中國)；Zeta電位儀Zetasizer Nano ZS(Malvern公司，英國)；脂質體擠出器LF-1(Avestin公司，美國)；托利多XP6百萬分之一超微量天平(梅特勒，德國).

1.2 脂質體(LP)的制備—薄膜水化法

使用超微量天平，精密稱量39 mg鞘磷脂、15 mg膽固醇、12 mg DSPE-PEG、2 mg Mal-PEG2000-DSPE于250 mL茄型旋轉蒸發(fā)瓶中，溶于8 mL氯仿.37 ℃抽真空旋轉蒸發(fā)45-60 min至薄膜形成，高純氮氣吹盡殘留氯仿.加入6 mL 0.3 mol/L pH 4.0的檸檬酸溶液，順時針震搖旋轉蒸發(fā)瓶，把脂質薄膜從瓶壁上洗下來，得到半透明的脂質乳濁液.待水合完后，超聲1分鐘，使用脂質體擠出器，使其依次通過200、100、50 nm孔徑聚碳酸酯膜，每種膜擠過10-20次，得到粒徑均一的空白脂質體約5.5 mL.用截留分子量為1000的透析袋在0.3 mol/L檸檬酸溶液 (pH 4.0) 1 L透析6-8 h/次重復2次.每39 mg鞘磷脂加入0.4 mg CFPE [(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein) (ammoniumsalt) ]，利用上述制備方法制備熒光標記的脂質體Lip，隨后進行Anti-CD20 Fab’免疫化修飾獲得免疫化熒光脂質體Clip和BSA修飾免疫熒光脂質體Nlip，免疫化和BSA修飾方法如下所述[15].

1.3 長春新堿脂質體(LPV，Liposome-Vincristine)制備—pH值梯度法

取透析后的脂質體溶液0.2 mL，1 mg/mL長春新堿溶液0.5 mL，加入0.6 mL 1 mol/L Na2HPO4溶液中；將溶液pH值調至7.0，再加水補至2 mL體積，50 ℃水浴孵育10 min.取脂質體溶液加入到截留分子量為1000的透析袋中，置于1 L PBS溶液透析，6-8 h/次，共兩次.

1.4 Anti-CD20 Fab’免疫化長春新堿脂質體(CLPV)制備

Anti-CD20 Fab’巰基化，Anti-CD20 Fab’與2-IT(2-Iminothiolane.HCL，蛋白巰基化試劑)，按1:200的摩爾比例混合，室溫下輕柔搖擺反應2 h，混勻樣品.使用分子量1000透析袋，在1 L含5 mM EDTA的預冷PBS透析液中，透析去除未反應的2-IT，低速輕柔磁力攪拌，4 ℃，6-8 h，中間換液兩次.通過BCA法測蛋白濃度和Ellman法測巰基濃度共同計算抗體片段的巰基化程度.使用Stewart分析法測定LPV脂質度，計算出Mal-PEG2000-DSPE濃度.按Mal-PEG2000-DSPE：Anti-CD20 Fab’摩爾比為1:10吸取LPV和巰基化的Anti-CD20 Fab’混勻，于16 ℃孵育過夜.使用分子量100000的透析袋去除游離的Anti-CD20 Fab’，PBS透析6 h，每2 h換一次液.

1.5 BSA修飾長春新堿脂質體(NCLPV)對照脂質體制備

制備方法與CLPV的制備流程相同，只是用BSA(牛血清白蛋白)替代Anti-CD20 Fab’，其他條件不變.

1.6 粒徑測定

使用英國Malvern公司Zetasizer Nano ZS分析儀測定樣品的粒徑與zeta電位，每份樣品重復3次.

1.7 包封率測定

配制1 mg/mL VCR水溶液，倍比稀釋得到0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL溶液.紫外分光光度計(Agilent公司)，用400 μL 1%的TritonX-100，298 nm調零.分別取100 μL各濃度的長春新堿溶液加入700 μL 1%的TritonX-100溶液，制定標準曲線.取已透析好的長春新堿脂質體50 μL加入350 μL 1%的TritonX-100，渦旋1 min，室溫放置5 min.檢測其298 nm處光吸收度，代入建好的標準曲線，即可得到脂質體包封長春新堿的濃度.通過公式計算包封率，包封率=(脂質體中包封的藥物/制備脂質體所加藥物總量)×100%

1.8 免疫脂質體的靶向特異性檢測

制備插入CFPE(488 nm激發(fā)發(fā)綠光熒光染料)的空白脂質體(Lip).分別用上述修飾方法用anti-CD20-Fab’和BSA修飾Lip，透析去除未連接的抗體和BSA獲得免疫熒光脂質體Clip和NLip.將Clip、NLip和Lip分別與Raji和Ramos細胞孵育，4 ℃，1 h.然后使用BD流式細胞儀進行熒光檢測.

1.9 細胞殺傷實驗

以每孔3000個細胞分別接種Raji和Ramos細胞于96孔培養(yǎng)板(每孔100 μL).每孔加入9 μg/mL、3 μg/mL、1 μg/mL、0.3 μg/mL的CLPV、NCLPV和長春新堿溶液.每種藥物設3個復孔，另設不加藥物對照組.37 ℃，7% CO2中繼續(xù)培養(yǎng).分別在給藥后24 h和48 h，使用CCK-8 Kit試劑盒測定細胞的增殖效率.

2 結果與分析

2.1 脂質體粒徑檢測

應用英國Malvern公司的Zeta電位儀Zetasizer Nano ZS分別檢測空載脂質體LP、包封長春新堿脂質體LPV，anti-CD20 Fab’免疫化長春新堿脂質體CLPV和BSA修飾長春新堿脂質體NCLPV粒徑.結果顯示脂質體在經過脂質體擠出器多次擠出后，LP，LPV，CLPV，NCLPV的平均粒徑分別為134、140、141、150 nm，四種脂質體平均粒徑均小于200 nm, 分布均勻，呈正態(tài)性，跨距較小(圖1).

注：(A)空載脂質體LP，(B)包封長春新堿脂質體LPV，(C)anti-CD20 Fab’免疫化長春新堿脂質體CLPV，(D) BSA修飾長春新堿脂質體NCLPV粒徑.

圖1脂質體粒徑檢測

2.2 包封率

圖2 標準曲線

首先制備長春新堿1%的TritonX-100溶液298 nm濃度-光吸收標準曲線(圖2)，50 μL制備好的長春新堿脂質體加入350 μL 1%的TritonX-100測得OD值0.365，將測得的OD值代入方程y=1.7304x-0.007，OD值為Y值，計算可得濃度為0.215 mg/mL，包裹的總體積為2 mL，即：0.215 mg/mL×2 mL=0.43 mg，脂質體制備時長春新堿投料量為0.5 mg，所以測得包封率.包封率=(脂質體中包封的藥物/制備脂質體所加藥物總量)×100%=0.43/0.5×100%=86%.

2.3 免疫化脂質體與CD20陽性細胞的結合特異性

熒光標記的脂質體Lip， Anti-CD20 Fab’免疫化熒光脂質體Clip和BSA修飾免疫熒光脂質體Nlip，分別與CHO細胞(CD20-)、Raji細胞(CD20+)以及Ramos細胞(CD20+)孵育，流式細胞儀檢測他們與CHO細胞(圖3)、Raji細胞(圖4)以及Ramos細胞(圖5)的結合特異性.三種脂質體與CHO均幾乎不能結合，Clip可以與CD20+細胞Raji和Ramos高親和力特異性結合(結合率分別達到90.3%和83.0%)，非免疫化Lip與BSA修飾Nlip與CD20+細胞Raji和Ramos幾乎不能結合.

注：(A)Clip與CHO細胞的結合率為3.66%；(B)Nlip與CHO細胞的結合率為1.45%；(C)Lip與CHO細胞的結合率為0.280%.

圖3免疫化和非免疫化脂質體與CHO細胞的結合特異性

注：(A) Clip與Raji細胞的結合率為90.3%；(B)Nlip與Raji細胞的結合率為1.36%；(C)Lip與Raji細胞的結合率為0.180%.

圖4免疫化和非免疫化脂質體與Raji細胞的結合特異性

注：(A)Clip與Ramos細胞的結合率為83.0%；(B)Nlip與Ramos細胞的結合率為1.10%；(C)Lip與Ramos細胞的結合率為0.290%.

圖5免疫化和非免疫化脂質體與Ramos細胞的結合特異性

2.4 CLPV、NCLPV和VCR對B淋巴瘤細胞的靶向殺傷

CLPV與NCLPV和VCR分別以0.3，1，3，9 μg/mL四個不同濃度梯度處理Raji和Ramos細胞24 h和48 h，CCK-8 kit試劑盒檢測細胞增值率，計算IC50(表1)，檢測CLPV與NCLPV和VCR對Raji和Ramos細胞的殺傷毒性.結果表明結果免疫化長春新堿脂質體24 h，48 h IC50值均遠低于NCLPV和VCR.CLPV較NCLPV和VCR顯著的提高了對B淋巴瘤細胞的殺傷作用(*p<0.05，**p<0.01)，而NCLPV和VCR的殺傷效果較低；從時間點上觀察，48 h的CLPV、NCLPV和VCR的細胞殺傷效果差距比24 h的差距更為明顯.含有相同長春新堿濃度的CLPV對B淋巴瘤細胞殺傷效果比NCLPV和VCR的殺傷效果要提高10%-25%(圖6).

表1 制備的各種脂質體的IC50值

3 討論

惡性腫瘤現已超越心腦血管疾病成為全球第一位的死亡病因.據2011年公布的全球最新最全的癌癥統(tǒng)計數據，2008年全世界約有1270萬癌癥新增患者，760萬人死于癌癥.世界衛(wèi)生組織估計到2020年前，全球每年新增癌癥患者將達到1500萬.

化學藥物治療是當今癌癥治療的主要手段之一，臨床上有超過40種常用化療藥物用于治療各種癌癥.然而化療藥物往往因其對正常細胞和癌癥細胞無差別的毒性而“殺敵一千，自損八百”，引起嚴重的毒副作用.要進一步提高惡性腫瘤的醫(yī)療水平，除了研發(fā)新藥，開發(fā)現有臨床藥物的新劑型，提高其對癌癥組織的靶向性是一條切實可行的思路.自1965年Bangham等人發(fā)現了脂質體以來，經過眾多科研人員近五十年的不懈努力，脂質體以其生物體內可降解，毒性低，無免疫原性，肝、脾網狀內皮系統(tǒng)的被動靶向性等特性，作為藥物傳遞系統(tǒng)取得了許多里程碑式的工作，如：pH梯度包埋法的發(fā)明，長循環(huán)脂質體(隱型脂質體)的制備及主動靶向脂質體的發(fā)明等.現如今已經有阿霉素脂質體注射液Doxil，紫杉醇脂質體Taxosomes，阿霉素檸檬酸鹽脂質體注射液Myocet等多個脂質體藥物上市.

注：(A)處理Raji細胞24 h;(B)處理Raji細胞48 h;(C)處理Ramos細胞24 h;(D)處理Ramos細胞

48 h(*p<0.05，**p<0.01).

圖6 CLPV、NCLPV和VCR對B淋巴瘤細胞的靶向殺傷

本課題結合當前最先進的脂質體制備技術和單克隆抗體藥物的研發(fā)成果，探索一種以CD20+非霍奇金淋巴瘤為靶點的長循環(huán)免疫脂質體制備方法.以鞘磷脂、膽固醇、DSPE-P EG、Mal-PEG2000-DSPE為處方脂材制備脂質體，以pH梯度法DSPE-PEG的加入使脂質體表面PEG化，獲得長循環(huán)脂質體(隱型脂質體)降低脂質體的被動靶向性，以anti-CD20 Fab’對脂質體進行免疫化修飾，使脂質體具有主動靶向性.

通過粒徑和包封率對制備的脂質體進行表征分析.粒徑分析表明，我們獲得的長循環(huán)空白脂質體(LP)平均粒徑為134 nm.pH梯度法包封長春新堿后獲得的長循環(huán)長春新堿脂質體(LPV)粒徑較LP略有增大，平均粒徑為140 nm.而對LPV進行anti-CD20-Fab’修飾最終獲得長循環(huán)長春新堿免疫脂質體(CLPV)，平均粒徑141 nm，較LPV幾乎沒有變化.以上結果表明我們制備的長循環(huán)空白脂質體(LP)，長循環(huán)長春新堿脂質體(LPV)，長循環(huán)長春新堿免疫脂質體(CLPV)平均粒徑均在150 nm以下，作為藥物載體具有很好的粒徑分布范圍，而且粒徑分析圖也表明粒徑分布均勻，呈正態(tài)性，且跨距較小.包封率分析表明，我們獲得了86%的包封率，說明pH梯度法在將來的長春新堿脂質體工業(yè)化制備過程中具有良好的應用前景.

體外抗腫瘤實驗表明獲得的長春新堿免疫脂質體其具有較好的生物活性.結合特異性分析表明anti-CD20修飾脂質體對CD20+陽性的Raji和Ramos具有90%和83%的結合率，而非修飾脂質體和BSA修飾脂質體對照與兩種細胞的結合率均低于5%.然而anti-CD20修飾脂質體同非修飾脂質體和BSA修飾脂質體一樣與CD20-的CHO細胞結合率均低于5%，結合實驗說明anti-CD20修飾使脂質體其具有了與CD20+細胞的超強的靶向性特異性和超高的親和力，這就為脂質體特異性遞藥到腫瘤組織提供了保證.

體外殺傷實驗表明在相同長春新堿給藥濃度的情況下，長春新堿免疫脂質體(CLPV)比BSA修飾長春新堿脂質體(NCLPV)和游離長春新堿(VCR)對CD20+細胞Raji細胞和Ramos的24 h和48 h殺傷能力都更強，殺傷效率提高10-25%左右.IC50計算得到CLPV的對Raji和Ramos細胞的24 h，48 h殺傷的IC50值都是NCLPV和VCR50%以下，預示著臨床上可以顯著降低給藥劑量，進一步降低藥物毒性.以上實驗表明Anti-CD20 Fab’通過提高長春新堿脂質體對CD20+的靶向特異性和結合效率賦予了長春新堿脂質體良好的體外抗腫瘤細胞的活性.