徐令清,張岡毅,鐘子瑩,溫偉洪,湯英賢,鐘國(guó)權(quán),李介華,劉麗忠

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院/清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東清遠(yuǎn) 511518)

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS)是一種新型的軟電離生物質(zhì)譜儀，對(duì)臨床微生物的細(xì)菌鑒定具有非常大的作用，不僅能快速鑒定純菌落，還能直接從臨床標(biāo)本中檢測(cè)細(xì)菌，不需培養(yǎng)，只需進(jìn)行簡(jiǎn)單的預(yù)處理，如離心、血細(xì)胞溶解等，還可以進(jìn)行分子水平的基因分型、藥物敏感性分析和無(wú)菌體液的直接鑒定等。目前，臨床主要依靠傳統(tǒng)手工法及自動(dòng)化鑒定儀檢測(cè)病原微生物，傳統(tǒng)的技術(shù)具有周期長(zhǎng)、費(fèi)用高、鑒定能力有限和信息滯后的缺陷。但MALDI-TOF MS能夠完成微生物多種成分的分析，包括蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、多肽等[1]。MALDI-TOF MS技術(shù)應(yīng)用于細(xì)菌的鑒定，實(shí)際上就是檢測(cè)具有屬、種或亞型特異性的生物標(biāo)志物質(zhì)量信號(hào)，它主要通過(guò)分析不同細(xì)菌具有的不同蛋白質(zhì)指紋圖譜，對(duì)鑒定結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的細(xì)菌進(jìn)行比對(duì)，得出各種細(xì)菌鑒定結(jié)果。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 收集2018年10月至2019年3月本院住院及門(mén)診患者的清潔中段尿液標(biāo)本共300份。

1.2儀器與試劑 儀器：MALDI-TOF MS購(gòu)自德國(guó)布魯克公司，Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)(Vitek 2 Compact)購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司，BD phoenixM50全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)(BD M50)購(gòu)自美國(guó)BD公司，T100TMPCR擴(kuò)增儀、電泳儀、Gel DoxTM XR+凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。試劑：MALDI-TOF MS所用試劑包括三氟乙酸、色譜級(jí)乙腈、70%甲酸和無(wú)水乙醇，均為廠家配套試劑。哥倫比亞血瓊脂平板購(gòu)自廣州迪景微生物科技有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix、Gel Red核酸染料和Marker DNA Ladder購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3方法

1.3.1尿液標(biāo)本培養(yǎng) 采用10 μL的接種環(huán)將中段尿液標(biāo)本接種于哥倫比亞血瓊脂平板上，37 ℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h。

1.3.2尿液標(biāo)本質(zhì)譜分析前處理 取10 mL的尿液標(biāo)本倒入無(wú)菌的15 mL離心管中，以2 000 r/min轉(zhuǎn)速離心4 min，去除蛋白。離心完畢后，將上清液倒入另外一支無(wú)菌的15 mL離心管中，在20 ℃下以12 000 r/min離心5 min。棄上清液，在沉淀中加入1 mL 0.45%氯化鈉注射液，轉(zhuǎn)到1.5 mL的EP管中，充分振蕩混勻后12 000 r/min離心5 min。棄上清液，用1 mL去離子水洗滌沉淀，同樣轉(zhuǎn)速和時(shí)間離心，棄上清液，留沉渣待用。

1.3.3MALDI-TOF MS分析尿沉渣 采用加樣槍吸取1 μL沉淀物均勻涂抹于96孔靶板上，待干燥。再加入1 μL 70%甲酸，干燥，再加上1 μL基質(zhì)液涂抹均勻，干燥后進(jìn)行質(zhì)譜分析。標(biāo)本干燥后將靶板放入MALDI-TOF MS檢測(cè)。MALDI-TOF MS收集的質(zhì)量范圍為2 000～20 000 Da，圖譜采集使用Flex Control軟件，使用Bruker Biotyper軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，用分值量化和判定結(jié)果，評(píng)分≥2.0分表示可鑒定到種的水平；評(píng)分為1.7～<2.0分表示可鑒定到屬的水平；評(píng)分<1.7分則表示無(wú)法給出可信的鑒定結(jié)果。

1.3.4菌落鑒定 首先采用MALDI-TOF MS進(jìn)行菌落鑒定，然后使用Vitek 2 Compact、BD M50兩種儀器對(duì)菌落進(jìn)行復(fù)核鑒定。

1.3.516sRNA檢測(cè) 尿沉渣直接通過(guò)MALDI-TOF MS分析得到的陽(yáng)性結(jié)果中挑選出7株細(xì)菌提取DNA，進(jìn)行16sRNA擴(kuò)增，具體操作參照文獻(xiàn)[13]。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，驗(yàn)證MALDI-TOF MS的準(zhǔn)確性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Excel2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.13種儀器對(duì)單一菌感染尿液標(biāo)本培養(yǎng)菌落鑒定符合率 300份中段尿液標(biāo)本中，3種儀器均檢測(cè)出單一菌感染63株，其中肺炎克雷伯菌8株，大腸埃希菌40株，糞腸球菌9株，銅綠假單胞菌3株，產(chǎn)氣腸桿菌1株，里昂葡萄球菌1株，黏質(zhì)沙雷菌1株，MALDI-TOF MS菌落鑒定結(jié)果與BD M50 及Vitek 2 Compact檢測(cè)結(jié)果一致，符合率為100.0%。尿液標(biāo)本培養(yǎng)結(jié)果表明，革蘭陰性菌為尿路感染主要的致病菌，大腸埃希菌最為常見(jiàn)(57.7%)，肺炎克雷伯菌次之(15.4%)；革蘭陽(yáng)性菌也占少數(shù)，以糞腸球菌為主(7.7%)。

2.2單一菌感染中MALDI-TOF MS檢測(cè)尿沉渣與菌落鑒定結(jié)果的比較 MALDI-TOF MS直接檢測(cè)尿沉渣共得到25份陽(yáng)性結(jié)果，尿沉渣總檢出率為39.7%(25/63)；其中肺炎克雷伯菌培養(yǎng)后采用MALDI-TOF MS進(jìn)行菌落鑒定共檢出菌株8株，尿沉渣檢出4株，尿沉渣檢出率為50.0%；大腸埃希菌培養(yǎng)后采用MALDI-TOF MS進(jìn)行菌落鑒定共檢出菌株40株，尿沉渣檢出15株，尿沉渣檢出率為37.5%；糞腸球菌培養(yǎng)后采用MALDI-TOF MS進(jìn)行菌落鑒定共檢出菌株9株，尿沉渣檢出2株，尿沉渣檢出率為22.2%；銅綠假單胞菌培養(yǎng)后采用MALDI-TOF MS進(jìn)行菌落鑒定共檢出菌株3株，尿沉渣檢出1株，尿沉渣檢出率為33.3%；產(chǎn)氣腸桿菌、里昂葡萄球菌、黏質(zhì)沙雷菌培養(yǎng)后采用MALDI-TOF MS進(jìn)行菌落鑒定共檢出菌株各1株，尿沉渣檢出各1株，尿沉渣檢出率均為100.0%。 見(jiàn)表1。

表1 單一菌感染的中段尿液標(biāo)本菌株檢出情況

2.3混合菌感染中MALDI-TOF MS尿沉渣檢測(cè)與菌落鑒定結(jié)果的比較 培養(yǎng)結(jié)果為兩種細(xì)菌感染的標(biāo)本有20份，MALDI-TOF MS進(jìn)行培養(yǎng)菌落鑒定的優(yōu)勢(shì)菌為糞腸球菌6株(30.0%)，大腸埃希菌5株(25.0%)，溶血葡萄球菌4株(20.0%)，無(wú)乳鏈球菌2株(10.0%)，屎腸球菌2株(10.0%)，銅綠假單胞菌1株(5.0%)，非優(yōu)勢(shì)菌主要為表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、棒狀桿菌、氣單胞菌、鏈球菌等常見(jiàn)污染菌，而MALDI-TOF MS直接從2份尿沉渣中檢出2株屎腸球菌(優(yōu)勢(shì)菌>104CFU/mL)，檢出率為10.0%(2/20),其他優(yōu)勢(shì)菌及非優(yōu)勢(shì)菌在尿沉渣中均未直接檢出。

2.416sRNA擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果 7株細(xì)菌擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1，測(cè)序經(jīng)過(guò)https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi網(wǎng)站BLAST比對(duì)，分別為肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣腸桿菌、里昂葡萄球菌、黏質(zhì)沙雷菌，與Vitek 2 Compact及MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果完全一致。

注：M為標(biāo)記物，200～4 500 bp；泳道1～7分別為肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣腸桿菌、里昂葡萄球菌、黏質(zhì)沙雷菌。圖1 7株細(xì)菌16sRNA擴(kuò)增結(jié)果

3 討 論

MALDI-TOF MS以快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、高通量的特點(diǎn)在細(xì)菌的鑒定、耐藥性和毒力監(jiān)測(cè)中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用[2]。MALDI-TOF MS還應(yīng)用于其他方面的研究，例如用于流行病學(xué)的研究、基因分型、血培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)瓶的直接鑒定(MALDI SepsityperTM試劑盒)和其他體液或選擇性肉湯培養(yǎng)標(biāo)本的直接鑒定等。傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)和生化鑒定方法無(wú)法對(duì)大腸埃希菌、沙門(mén)氏菌、霍亂弧菌等多種血清型病原菌進(jìn)行分類(lèi)，而現(xiàn)在MALDI-TOF MS對(duì)多種血清型細(xì)菌進(jìn)行鑒定和分類(lèi)已得到初步應(yīng)用[3]。王曄茹等[4]應(yīng)用優(yōu)化的MALDI-TOF MS試驗(yàn)條件對(duì)含有沙門(mén)氏菌的患者糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)和分型，并與血清學(xué)分型進(jìn)行比較。對(duì)于血培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)的標(biāo)本，MALDI-TOF MS的鑒定率較高，可用于處理混合感染的標(biāo)本；KOK等[5]使用MALDI SepsityperTM試劑盒對(duì)507份血培養(yǎng)陽(yáng)性的標(biāo)本直接進(jìn)行MALDI-TOF MS檢測(cè)，鑒定出379份(74.8%)陽(yáng)性標(biāo)本，其中358份為單一菌感染，21份為混合菌感染。

目前，MALDI-TOF MS技術(shù)在臨床微生物的診斷上具有優(yōu)勢(shì)，主要應(yīng)用于細(xì)菌和真菌的菌種鑒定，但是在某些方面還是存在不足。如在檢測(cè)單一菌種的標(biāo)本時(shí)，MALDI-TOF MS 的檢測(cè)結(jié)果可能無(wú)法達(dá)到菌落鑒定的相對(duì)分值，如菌落鑒定為大腸埃希菌的40份尿液標(biāo)本中，有11份標(biāo)本直接檢測(cè)評(píng)分≥2.0分，4份標(biāo)本評(píng)分為1.7～<2.0分，1份標(biāo)本評(píng)分<1.7分，剩余14份標(biāo)本無(wú)圖譜，而其他尿沉渣檢測(cè)不是大腸埃希菌的標(biāo)本有10份。造成上述這種現(xiàn)象的主要原因可能包括標(biāo)本中細(xì)菌的含量少，菌量不一，存在部分的干擾物質(zhì)，光譜采集不準(zhǔn)確等；而菌量較多的峰圖信號(hào)好，鑒定值高，結(jié)果可靠；菌量少的峰圖信號(hào)不好，鑒定準(zhǔn)確度不高，檢測(cè)結(jié)果不佳；未檢出的和無(wú)法鑒定是大腸埃希菌的標(biāo)本可能是因?yàn)榫刻?，也有可能是尿液?biāo)本中還存在蛋白質(zhì)、混合細(xì)菌等干擾物質(zhì)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不可靠[6-7]。也有學(xué)者提出“短期培養(yǎng)法”，4～6 h后采集菌膜并用MALDI-TOF MS直接檢測(cè)，準(zhǔn)確率可得到明顯提高[8]。

在本研究中，中段尿液標(biāo)本經(jīng)培養(yǎng)后菌落鑒定為單一菌感染的63份標(biāo)本，而MALDI-TOF MS檢測(cè)尿沉渣的鑒定陽(yáng)性率為39.7%(25/63)；兩種細(xì)菌混合感染的標(biāo)本有20份，MALDI-TOF MS鑒定的陽(yáng)性率為10.0%(2/20)。從中可以看出兩種細(xì)菌混合感染的陽(yáng)性率遠(yuǎn)低于單一細(xì)菌感染的陽(yáng)性率[9]。而WANG等[10]的研究發(fā)現(xiàn)尿液標(biāo)本中兩種細(xì)菌只有優(yōu)勢(shì)菌能夠被檢出。在本研究中，MALDI-TOF MS檢測(cè)混合菌感染的中段尿液標(biāo)本時(shí)，優(yōu)勢(shì)菌數(shù)量比非優(yōu)勢(shì)菌數(shù)量高一個(gè)數(shù)量級(jí)，受非優(yōu)勢(shì)菌干擾的概率較低。

MALDI-TOF MS直接檢測(cè)尿沉渣與尿液標(biāo)本培養(yǎng)菌落鑒定有一定的差異，可能受到以下幾種因素影響[11]：(1)尿液標(biāo)本直接洗滌離心，細(xì)菌和蛋白可能混在沉淀中，導(dǎo)致質(zhì)譜峰圖不佳，檢出率低；(2)尿液標(biāo)本沒(méi)有經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，菌量少，從而無(wú)法得出鑒定結(jié)果；(3)MALDI-TOF MS光譜采集不準(zhǔn)確，菌量低于檢出限等。

尿路感染是人類(lèi)常見(jiàn)的感染性疾病，95%以上的尿路感染是由單一細(xì)菌引起的，其中約90%的門(mén)診患者和50%的住院患者感染的病原菌為大腸埃希菌，但也有少部分患者感染金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、念珠菌等。傳統(tǒng)的尿路感染診斷依靠尿液分析、尿沉渣技術(shù)、革蘭染色鏡檢和細(xì)菌培養(yǎng)等，但目前臨床更偏向于使用快速準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)。有研究對(duì)尿路感染的220份尿液標(biāo)本進(jìn)行常見(jiàn)的MALDI-TOF MS直接鑒定，當(dāng)菌量>105CFU/mL時(shí)，鑒定到屬的檢出率為92.7%，鑒定到種的檢出率為91.8%，特別是對(duì)大腸埃希菌的鑒定，檢出率達(dá)到97.6%，檢出時(shí)間也極大縮短[12]。臨床上尿液標(biāo)本的培養(yǎng)一般需要24 h，應(yīng)用MALDI-TOF MS則可以快速完成菌種的鑒定。對(duì)于混合菌感染的尿液標(biāo)本，MALDI-TOF MS也可報(bào)告優(yōu)勢(shì)菌，節(jié)省了分純培養(yǎng)的時(shí)間,為獲得更好的治療爭(zhēng)取了時(shí)間并減少了費(fèi)用。而16sRNA擴(kuò)增技術(shù)的靈敏度與培養(yǎng)結(jié)果具有很好的一致性；并且在診斷使用過(guò)抗菌藥物的患者標(biāo)本中，具有更多的優(yōu)越性[13]。

4 結(jié) 論

MALDI-TOF MS的推廣和使用，不僅能優(yōu)化檢驗(yàn)流程，還可以節(jié)省大量的成本和時(shí)間，快速準(zhǔn)確地鑒定病原菌，對(duì)臨床細(xì)菌感染的診斷及治療具有重大意義。