黃玉蘭，韓聲付，曾林子，肯 布，張光慧，賈春燕，彭秀娟，楊小蓉△

(1.四川省疾病預(yù)防控制中心，四川成都 610041；2.爐霍縣疾病預(yù)防控制中心，四川甘孜 626500；3.綿陽市第三人民醫(yī)院/四川省精神衛(wèi)生中心檢驗科,四川綿陽 621000)

新型冠狀病毒屬于冠狀病毒科β屬，包括29 891個核苷酸，并編碼9 860個氨基酸，與嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)同源性為82%[1]，其傳染性強于SARS-CoV[2-3]。根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》，實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測新型冠狀病毒核酸陽性為確診病例的病原學(xué)金標(biāo)準(zhǔn)之一[4]。實時熒光PCR技術(shù)具有結(jié)果直觀，重復(fù)性好、特異性強、靈敏度高和易操作等優(yōu)點[5]。然而，核酸檢測的準(zhǔn)確性也會受標(biāo)本質(zhì)量、運輸、儲存條件、核酸檢測試劑性能及PCR儀等因素影響[6]。為了解實時熒光PCR儀對核酸檢測結(jié)果的影響，本研究擬對同一批標(biāo)本使用同一廠家、同一批號新型冠狀病毒核酸檢測試劑，在3種不同廠家生產(chǎn)的實時熒光PCR儀上進行平行檢測，并對檢測結(jié)果進行比較分析，供儀器廠家和檢測機構(gòu)參考。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 120份咽拭子、尿液、糞便及唾液標(biāo)本采集自120例有臨床癥狀的新型冠狀病毒肺炎患者及其密切接觸者，其中咽拭子標(biāo)本81份，尿液標(biāo)本14份，唾液標(biāo)本14份，糞便標(biāo)本11份。所有標(biāo)本采集及運輸均符合《新型冠狀病毒實驗室檢測技術(shù)指南(第五版)》[7]要求。

1.2儀器與試劑 全自動核酸提取儀NatchS(圣湘生物科技股份有限公司，長沙)；本試驗選取國內(nèi)外3個廠家(編號為A、B、C)生產(chǎn)的不同型號實時熒光PCR儀對標(biāo)本進行檢測。病毒標(biāo)本采集保存液(梓健生物科技有限公司，深圳，批號:2020013001)；新型冠狀病毒核酸提取試劑盒(圣湘生物科技股份有限公司，長沙，批號2019002、2020004)，靶基因位點為開放讀取框(ORF)1ab和核殼蛋白(N)基因，其檢出限為200 copy/mL；TRIzol?Reagent試劑(Ambion公司,美國，批號:15596026)。

1.3方法 試驗操作均按照《新型冠狀病毒PCR實驗室生物安全要求(第二版)》[8]。所有標(biāo)本預(yù)先放置到56 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，進行30 min滅活處理。

1.3.1標(biāo)本前處理 (1)糞便標(biāo)本:用棉簽挑取黃豆粒大小糞便標(biāo)本至50 mL無菌離心管中，加入2 mL TRIzol?Reagent，混合均勻，靜置10 min后吸取600 μL上清液至1.5 mL離心管，5 000 r/min離心5 min，吸取上清液待用。(2)唾液標(biāo)本:加入400 μL病毒保存液混合均勻后待用。(3)咽拭子標(biāo)本:混合均勻后待用。

1.3.2核酸提取 分別吸取200 μL前處理標(biāo)本，采用全自動核酸提取儀NatchS及核酸提取試劑盒(圣湘生物科技股份有限公司，長沙)，按照說明書步驟進行核酸提取。

1.3.3核酸擴增 按照新型冠狀病毒核酸檢測試劑說明書配制反應(yīng)體系，分別采用A、B、C 3種實時熒光PCR儀，按照說明書設(shè)置反應(yīng)程序，對120份標(biāo)本進行檢測，并對結(jié)果進行判定，若ORF1ab及N基因Ct值均<40，結(jié)果判為陽性；若僅有單個基因Ct值<40，結(jié)果判為單基因陽性；若ORF1ab及N基因Ct值均>40，結(jié)果判為陰性。

1.3.4質(zhì)量控制 每批次試驗均帶有陰、陽性對照及內(nèi)標(biāo)，陰、陽性結(jié)果符合，且內(nèi)標(biāo)Ct值<40，則該批次檢測結(jié)果有效，反之需重復(fù)試驗。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，3種檢測結(jié)果比較采用配對χ2檢驗。通過計算Kappa值，分析檢測結(jié)果一致性:K≥0.75一致性好，0.40≤K<0.75一致性一般，K<0.40一致性差。

2 結(jié) 果

2.13種儀器基本情況 3種儀器生產(chǎn)日期、溫控方式、光源等存在差異，儀器基本情況比較見表1。

表1 3種儀器基本情況比較

2.23種儀器檢測結(jié)果 儀器A檢出陽性51例，陰性40例，單基因陽性29例(均為N基因陽性)，檢出率為42.50%(51/120)。儀器B檢出陽性42例，陰性54例，單基因陽性24例(1例ORF1ab基因陽性，其余N基因陽性)，檢出率為35.00%(42/120)。儀器C檢出陽性46例，陰性49例，單基因陽性25例(均為N基因陽性)，檢出率為38.33%(46/120)。

2.33種儀器檢測結(jié)果一致性 120例患者標(biāo)本，有95例通過3種儀器擴增后檢測結(jié)果一致，其中陽性41例，陰性40例，單基因陽性14例，25例檢測結(jié)果不一致，見表2。由于研究使用的新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒說明書申明適用儀器為A，因此，將儀器A檢測結(jié)果作為參照進行比較，儀器B擴增后有99例與儀器A結(jié)果一致，其中陽性42例，陰性40例，單基因陽性17例；儀器C擴增后有106例與儀器A結(jié)果一致，其中陽性46例，陰性40例，單基因陽性20例。

表2 3種儀器檢測結(jié)果差異

2.4儀器A與儀器B檢測結(jié)果一致性比較 120例標(biāo)本運用儀器A及儀器B擴增后，儀器A檢出陽性標(biāo)本51例，儀器B與儀器A一致的有42例，儀器B將其中8例檢測為單基因陽性(1例ORF1ab陽性，7例N基因陽性)，1例檢測為陰性；進行χ2檢驗，儀器A和儀器B檢出率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，兩種儀器檢測結(jié)果間一致性一般(K=0.732)， 檢測結(jié)果一致性見表3。

表3 儀器A及儀器B擴增檢測結(jié)果一致性比較(n)

2.5儀器A與儀器C檢測結(jié)果一致性比較 120例患者標(biāo)本采用儀器A及儀器C擴增后，儀器A檢出陽性51例，儀器C與儀器A一致的有46例，儀器C將其中5例檢測為單基因陽性(均為N基因陽性)；進行χ2檢驗，儀器A和儀器C檢出率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，兩種儀器檢測結(jié)果間一致性好(K=0.821)，檢測結(jié)果一致性見表4。

表4 儀器A及儀器C擴增檢測結(jié)果一致性比較(n)

3 討 論

本研究采用的標(biāo)本類型為新型冠狀病毒肺炎確診患者及密切接觸者的咽拭子、糞便、尿液和唾液標(biāo)本，3種儀器均適合對不同標(biāo)本提取的核酸進行檢測。本試驗采用的核酸檢測試劑盒說明書上標(biāo)示適用儀器為儀器A，本研究僅針對各儀器相應(yīng)型號進行比較。

2020年1月9日，我國科研人員通過測序成功破譯出新型冠狀病毒全基因組序列，并提交在virologic.org網(wǎng)站和GenBank。隨后市面上各種檢測新型冠狀病毒的商品化試劑盒相繼面世，其中PCR方法由于其靈敏度高、特異性強，目前已成為檢測新型冠狀病毒核酸的主要方法[9]。檢測靶標(biāo)主要有ORF1ab、N基因及包膜蛋白(E)基因上的特異性保守序列，也有少數(shù)商品試劑盒同時檢測刺突糖蛋白(S)基因，實驗室針對新型冠狀病毒的核酸檢測應(yīng)至少包含最為保守及特異的ORF1ab及N基因[10-12]。內(nèi)源性檢測系統(tǒng)(內(nèi)標(biāo)，IC)主要用于對標(biāo)本采集、核酸提取及擴增過程進行監(jiān)控，避免外部因素造成假陰性結(jié)果[13-15]。本研究所用的新型冠狀病毒核酸檢測試劑檢測目的基因為ORF1ab及N基因，同時含有內(nèi)源性檢測系統(tǒng)，其最低檢出限為200 copy/mL，盡可能避免由于試劑靈敏度等原因?qū)x器檢出結(jié)果造成影響。

溫控模塊、熒光激發(fā)是實時熒光PCR儀的關(guān)鍵裝置，不同品牌儀器的溫控模塊及熒光激發(fā)系統(tǒng)有所不同。如果實時熒光PCR儀與試劑的匹配性不好，就可能會影響到檢測結(jié)果。本研究中所用試劑說明書指明最適儀器為儀器A，與之檢測結(jié)果相比，運用儀器B檢測結(jié)果一致性一般，運用儀器C檢測結(jié)果一致性好。因此，在實際工作中，如果實驗室沒有配置與檢測試劑盒匹配的實時熒光PCR儀，那么應(yīng)運用多種質(zhì)控手段確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

從軟件操作及結(jié)果分析來比較，儀器A和儀器B為中文操作界面，適應(yīng)人群更廣，特別是對基層人員更容易操作，便于分析。而儀器C的全英文操作界面對操作人員英文水平有一定要求，且在結(jié)果分析時，與前兩者相比不能同時選擇3個通道查看結(jié)果，操作上較為復(fù)雜。值得注意的是，由于本研究試劑盒選擇FAM(ORF1ab)、ROX(N基因)、HEX(內(nèi)標(biāo))通道進行檢測，分別對應(yīng)波長為470～510、580～620、530～565 nm，而儀器C僅有與HEX通道波長相近的VIC通道，其波長為533～580 nm，因此與測定N基因的ROX通道波長有交叉，影響結(jié)果判定，因此，需要通過顏色補償校準(zhǔn)ROX和HEX通道，修正內(nèi)標(biāo)和N基因之間的干擾。

實時熒光PCR儀是精密復(fù)雜的儀器，電子元件的性能也會隨著使用年限增加而逐漸老化，影響檢測結(jié)果。本研究中使用的儀器C為2012年購置，未進行定期校正，可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，定期對實時熒光PCR儀進行校正非常必要。

4 結(jié) 論

通過對不同型號實時熒光PCR儀檢測新型冠狀病毒肺炎標(biāo)本結(jié)果比較分析，3種儀器檢測結(jié)果和檢測一致性存在一定差異，提示廠家需進一步優(yōu)化儀器性能，同時各檢測機構(gòu)應(yīng)按照要求對實時熒光PCR儀進行校準(zhǔn)維護，確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確性。