周雪原，馬玉珍，李 靈，秦 磊，龐曉燕，侯東霞，冀小平△，王曉華▲

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院遺傳優(yōu)生科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020； 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院生殖中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010017)

耳聾是最常見的致殘疾病，據(jù)全國第二次殘疾人抽樣調(diào)查顯示，我國約有2 780萬聽力障礙人士，約占總殘疾人數(shù)的33.5%[1]。耳聾與外界環(huán)境和遺傳等多種因素有關(guān)，60%的耳聾與遺傳有關(guān)[2]。有研究表明，80%的遺傳性耳聾是由GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA、GJB3功能基因突變引起[3-5]。本研究采用聯(lián)合探針錨定聚合測序法檢測遺傳性耳聾常見的4個致病基因20個位點(diǎn)，了解內(nèi)蒙古自治區(qū)新生兒遺傳性耳聾基因突變情況，為本地區(qū)新生兒遺傳病防治、預(yù)防出生缺陷提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月1日至6月30日在內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院正常分娩的3 500例新生兒為研究對象，所有研究對象家屬均自愿讓新生兒接受遺傳性耳聾基因檢測，并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 華大生物科技有限公司核酸純化試劑、測序反應(yīng)通用試劑盒(聯(lián)合探針錨定聚合測序法)、遺傳性耳聾基因檢測試劑盒(聯(lián)合探針錨定聚合測序法)、基因測序儀(BGISEQ-500)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 3 500例新生兒均采集足跟血，并制成干血斑，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2基因組DNA提取 使用干血斑核酸提取試劑盒提取基因組DNA。DNA水平經(jīng)測定，在20～50 ng/μL為宜，-20 ℃暫存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3文庫制備 將提取基因組DNA標(biāo)本經(jīng)過打斷修復(fù)，接頭連接，PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫制備。配制打斷修復(fù)混合液，將基因組DNA打斷修復(fù)。每個標(biāo)本分別加入15 VL標(biāo)簽接頭，接頭與模板DNA結(jié)合，使每個模板都有特定標(biāo)簽并純化。對模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 120 s，1個循環(huán)；94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，35個循環(huán)；72 ℃ 300 s，1個循環(huán)；12 ℃暫存。擴(kuò)增產(chǎn)物純化并測定其水平，≥2 ng/μL為合格。

1.3.4測序 針對新生兒進(jìn)行的遺傳性耳聾基因篩查僅針對常見的基因及其相關(guān)位點(diǎn)，如有突變，原則上召回并行相關(guān)基因突變位點(diǎn)測序，進(jìn)一步給予臨床指導(dǎo)。采用測序反應(yīng)通用試劑盒(聯(lián)合探針錨定聚合測序法)進(jìn)行測序。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析應(yīng)用遺傳性耳聾基因分析軟件，按照測序后數(shù)據(jù)分析標(biāo)準(zhǔn)流程操作，至少兩人對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整理，并核對。

2 結(jié) 果

2.1耳聾基因突變率統(tǒng)計 3 500例新生兒血液標(biāo)本中，行遺傳性耳聾4個基因20個位點(diǎn)篩查，總突變193例，總突變率為5.51%；雜合突變178例(含線粒體異質(zhì)突變1例)，雜合突變率為5.09%；純合突變15例，純合突變率為0.43%。其中GJB2、GJB3、SLC26A4均為雜合突變，線粒體12SrRNA異質(zhì)突變1例，均質(zhì)突變15例。見表1。

表1 耳聾基因篩查各位點(diǎn)突變率

2.2基因突變患兒隨訪情況 3 500例新生兒中有193例異常結(jié)果，其中常染色體顯性遺傳非綜合征型耳聾相關(guān)GJB3基因雜合突變17例，均為538C>T位點(diǎn)突變；線粒體12SrRNA基因均質(zhì)突變15例，異質(zhì)突變1例。GJB3基因雜合突變與高頻聽力下降有關(guān)，可導(dǎo)致進(jìn)行性或遲發(fā)型中度至極重度耳聾。對本次檢測出的17例新生兒于2019年5月進(jìn)行電話回訪，家長表示1歲左右的受檢者暫時未發(fā)現(xiàn)癥狀，建議患兒來耳鼻喉科例行體檢，計劃2020年5月再回訪一次，持續(xù)監(jiān)測受檢者聽力損傷情況。線粒體12SrRNA基因突變15例，均電話告知若受檢者就醫(yī)需提醒醫(yī)生，該受檢者對氨基糖苷類藥物敏感，可出現(xiàn)“一針致聾”情況。2018年11月15例線粒體12SrRNA基因均質(zhì)突變受檢者母親、同胞、母親同胞姐妹、祖母等家族女性都做相應(yīng)突變基因驗證，發(fā)現(xiàn)除1例均質(zhì)突變受檢者無聯(lián)系方式未回訪，14例受檢者中，有5例存在家族遺傳史，其中2個家族為均質(zhì)突變遺傳，另3個家族有均質(zhì)突變和異質(zhì)突變病例；其余9例為新生兒突變，母親和同胞等家族女性檢測結(jié)果均正常，受精卵發(fā)育過程中出現(xiàn)相關(guān)基因突變。本研究對線粒體12SrRNA基因突變的家族分析，會在相應(yīng)的家族統(tǒng)計文章中詳細(xì)體現(xiàn)。

3 討 論

據(jù)國內(nèi)耳聾基因流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國遺傳性耳聾基因大部分由4個基因突變引起：GJB3、GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA，較常見的遺傳性耳聾突變基因為GJB2，其次為SLC26A4、線粒體12SrRNA、GJB3[6-9]。攜帶有遺傳性耳聾基因突變位點(diǎn)的女性在孕期可通過羊水穿刺對胎兒進(jìn)行耳聾基因檢測。對胎兒進(jìn)行耳聾基因突變情況及出生后干預(yù)評估，可避免下一代致聾或攜帶致病基因，有效降低生育耳聾新生兒的風(fēng)險。攜帶有線粒體12SrRNA相關(guān)突變位點(diǎn)的準(zhǔn)媽媽，可有效防止“一針致聾”，并對其子女做好藥物防護(hù)。有地方性研究發(fā)現(xiàn)新生兒耳聾基因陽性率高達(dá)4.98%[10-13]。本研究共檢測隨機(jī)時間段出生的3 500例新生兒，有193例新生兒存在單雜合耳聾基因突變，總突變率為5.51%，排除易感基因突變位點(diǎn)增多的因素，內(nèi)蒙古自治區(qū)新生兒遺傳性耳聾基因異常攜帶率明顯高于其他文獻(xiàn)報道[10-13]，本研究有一定臨床參考價值。

GJB2基因突變導(dǎo)致的耳聾為語前、雙側(cè)、對稱性耳聾，聽力損失程度變異較大，可由輕度到極重度，但多數(shù)為重度或極重度耳聾，GJB2基因和先天性耳聾有著密切關(guān)系。GJB2基因主要以常染色體隱性遺傳方式向后代傳遞，此類遺傳方式可通過分別獲取來自父母的致聾基因引起耳聾。GJB2基因突變是常見的耳聾基因，GJB2基因同一位點(diǎn)純合突變或兩個不同位點(diǎn)雜合突變均可致聾[14]。本研究檢測GJB2基因攜帶者有82例，雜合突變率為2.34%，攜帶者不會發(fā)病，但要密切關(guān)注，如果有聽力損失方面的臨床癥狀，建議做進(jìn)一步耳聾基因檢測，排除其他罕見耳聾基因位點(diǎn)突變。同時攜帶GJB2基因不同位點(diǎn)突變的夫妻，其子女發(fā)病風(fēng)險為1/4，攜帶風(fēng)險為1/2，正常概率為1/4。由于GJB2基因突變致聾符合人工耳蝸移植條件，可在出生18個月后進(jìn)行人工耳蝸移植，避免由聾致啞。

GJB3基因的相關(guān)突變臨床多表現(xiàn)為高頻聽力受損的進(jìn)行性語后聾。GJB3基因是在我國本土克隆的第一個疾病相關(guān)基因。本研究中GJB3基因突變17例，單雜合突變率0.49%，與全國基因突變率基本一致[15-16]。GJB3基因突變可導(dǎo)致常染色體顯性或隱性遺傳非綜合征型耳聾，GJB3基因編碼連接蛋白，547G>A為錯義突變，使連接蛋白31(Cx31)183號谷氨酸變?yōu)橘嚢彼幔?38C>T為無義突變，使180號堿基位置突然編碼終止。GJB2基因編碼的連接蛋白26與GJB3基因編碼的Cx31相互作用也可能引發(fā)耳聾。如果患者GJB3基因有突變，發(fā)現(xiàn)聽力下降需及時到耳鼻喉科就診，避免延誤病情。

SLC26A4是俗稱的“一巴掌致聾”基因，這個基因異常會導(dǎo)致后天遲發(fā)型耳聾，以及臨床上常見的大前庭水管綜合征。本研究中SLC26A4單雜合突變率為2.23%，與國內(nèi)地方統(tǒng)計數(shù)值基本一致[17]。SLC26A4基因異常者主要表現(xiàn)為聽力漸進(jìn)性下降，如劇烈運(yùn)動、頭部磕碰等顱內(nèi)壓劇烈變化的情況下聽力會出現(xiàn)明顯下降[18]。該基因遵循隱性遺傳的方式，大部分患兒的父母聽力正常，患兒出生時聽力正常，偶然一次玩耍、生病、打架之后致聾，如果提前預(yù)知其危險性，可避免或延緩耳聾的發(fā)生，將耳聾推遲至語言系統(tǒng)發(fā)育完善后。因此，盡早檢測SLC26A4基因?qū)和l(fā)育至關(guān)重要。

12SrRNA基因是線粒體基因，是俗稱的“一針致聾”基因，攜帶該基因突變者使用一次性劑量的氨基糖苷類抗菌藥物，如鏈霉素、慶大霉素等，便可致耳聾。本研究中有線粒體12SrRNA基因突變16例，突變率0.46%，與國內(nèi)其他地方統(tǒng)計值基本一致[19]。該基因為線粒體基因，遵循母系遺傳的方式。母親為耳聾型藥物的敏感人群，子女及其后代均為藥物性耳聾人群。藥物性耳聾基因的篩查能達(dá)到查出1人，預(yù)警10人的效果。

4 結(jié) 論

新生兒行遺傳性耳聾基因檢測具有重要而深遠(yuǎn)的意義，本研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)蒙古自治區(qū)4種常見耳聾基因20個位點(diǎn)突變率(總突變率為5.51%)略高于全國(總突變率為4.98%)和我國其他地區(qū)突變率，下一步考慮在本地區(qū)將新生兒篩查數(shù)擴(kuò)大，再統(tǒng)計遺傳性耳聾基因突變率，觀察是否有下降趨勢。新生兒遺傳性耳聾基因檢測在內(nèi)蒙古自治區(qū)持續(xù)推廣非常必要。