夏萬(wàn)松，夏 英,2，韋四喜，周春歡，杜 洪，袁 婷，金 泳，黃 ?！?/p>

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550004；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州貴陽(yáng) 550001；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，貴州貴陽(yáng) 550004；4.貴航貴陽(yáng)醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州貴陽(yáng) 550009)

乙醛脫氫酶2(ALDH2)rs671單核苷酸多態(tài)性(SNP)被鑒定為活性純合ALDH2 rs671(GG)、非活性雜合ALDH2 rs671(GA)、非活性純合ALDH2 rs671(AA)[1]。ALDH2 rs671SNP存在于世界近十分之一人口中，是人類最常見(jiàn)的變異，約5.4億人攜帶ALDH2 rs671SNP[2]。攜帶ALDH2 rs671SNP的個(gè)體飲酒后會(huì)出現(xiàn)酒精代謝障礙的表現(xiàn)，如面部潮紅和心率增加[3-4]。重要的是ALDH2 rs671SNP除了會(huì)引起酒精反應(yīng)外，還能影響某些藥物的代謝，危及攜帶者的健康。ALDH2 rs671SNP可增加胃癌、食管癌、上呼吸道鱗狀細(xì)胞癌的患病風(fēng)險(xiǎn)[5-9]。此外，ALDH2 rs671SNP與多種非癌癥疾病相關(guān)，是心肌梗死[10-11]、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的危險(xiǎn)因素[12]。ALDH2 rs671SNP也可以明顯增加髖部骨折風(fēng)險(xiǎn)[13]。然而，目前的研究較為局限，僅在DNA水平研究個(gè)體的ALDH2 rs671SNP與疾病的相關(guān)性，關(guān)于攜帶ALDH2 rs671SNP的個(gè)體ALDH2基因在信使RNA(mRNA)水平的改變研究尚比較少見(jiàn)。因此，本研究探討了ALDH2 rs671SNP的個(gè)體ALDH2基因在mRNA水平的改變，為進(jìn)一步揭示ALDH2 rs671SNP影響人類健康的機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料 將貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心的48例體檢者作為研究對(duì)象，收集所有研究對(duì)象外周抗凝全血標(biāo)本，其中男24例，女24例；年齡20～40歲。本研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 紅細(xì)胞裂解液購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，DNA及總RNA提取試劑盒、TRIZOL reagent、DNA純化試劑盒購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)所需引物合成及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物測(cè)序也由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司，Taq DNA聚合酶購(gòu)于美國(guó)Vazyme Biotech公司。ABI Pro FlexTM梯度PCR擴(kuò)增儀購(gòu)于賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，瓊脂糖水平電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠，GeneGnome凝膠成像分析儀購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.3方法

1.3.1位置特異性引物設(shè)計(jì) 于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)下載ALDH2基因的基本信息。設(shè)計(jì)上游引物671-F3734(位于內(nèi)含子11)和下游引物671-R165(位于內(nèi)含子12)可特異性擴(kuò)增含ALDH2 rs671SNP位點(diǎn)的片段。設(shè)計(jì)上游引物F1455(位于外顯子11)和下游引物R1740(位于外顯子13)可特異性擴(kuò)增含ALDH2 rs671SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)的片段。所有引物序列如下，671-F3734：5′-GTCCTGGGAGTGTAACCCAT-3′；671-R165：5′-CCCAGCAGGTCCTGAACTTC-3′；F1455：5′-GGACAAGGCCAATTACCTGT-3′；R1740：5′-ATTCAGCACGCAAGGATCAT-3′。

1.3.2DNA及總RNA提取、總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA 根據(jù)紅細(xì)胞裂解液產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)裂解人外周抗凝全血紅細(xì)胞，分別用于提取DNA和總RNA。根據(jù)DNA和總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取人外周抗凝全血白細(xì)胞 DNA和總RNA。取5 μg總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA。

1.3.3PCR擴(kuò)增及測(cè)序 為了擴(kuò)增位于外顯子12的ALDH2 rs671SNP位點(diǎn)，以上游引物671-F3734和下游引物671-R165進(jìn)行PCR擴(kuò)增可鑒定受試者的ALDH2 rs671SNP；以上游引物F1455和下游引物R1740進(jìn)行PCR擴(kuò)增可鑒定ALDH2 rs671SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的cDNA序列。引物示意圖見(jiàn)圖1A。PCR體系(25 μL)：2×Green Taq Mix 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸4 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，根據(jù)DNA純化試劑盒說(shuō)明書(shū)回收目的片段后進(jìn)行測(cè)序。以DNA為模板的PCR產(chǎn)物用上游引物671-F3734進(jìn)行測(cè)序，以cDNA為模板的PCR產(chǎn)物用上游引物F1455進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié) 果

2.1PCR擴(kuò)增白細(xì)胞的DNA和cDNA 用上游引物671-F3734和下游引物671-R165對(duì)白細(xì)胞的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的部分結(jié)果見(jiàn)圖1B。用上游引物F1455和下游引物R1740對(duì)白細(xì)胞的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的部分結(jié)果見(jiàn)圖1C。

注：A為ALDH2 mRNA及引物示意圖，僅展示ALDH2變異體1(Variant，V1)的3′端的3個(gè)外顯子，?代表外顯子(E)，?下方的數(shù)字表示外顯子堿基對(duì)(bp)的長(zhǎng)度，▼指示ALDH2 rs671SNP位點(diǎn)，→的位置表示引物的位置；B為PCR擴(kuò)增白細(xì)胞的DNA瓊脂糖凝膠電泳部分結(jié)果；C為PCR擴(kuò)增白細(xì)胞的cDNA瓊脂糖凝膠電泳部分結(jié)果。圖1 來(lái)自白細(xì)胞的DNA和cDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2PCR產(chǎn)物測(cè)序的結(jié)果 用上游引物671-F3734和下游引物671-R165對(duì)白細(xì)胞的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后用上游引物671-F3734進(jìn)行Sanger測(cè)序的結(jié)果見(jiàn)圖2A，通過(guò)測(cè)序結(jié)果可鑒定受試者的ALDH2 rs671SNP。用上游引物F1455和下游引物R1740進(jìn)行PCR擴(kuò)增白細(xì)胞的cDNA，PCR產(chǎn)物純化后以上游引物F1455進(jìn)行Sanger測(cè)序的結(jié)果見(jiàn)圖2B。在圖2A和圖2B中，當(dāng)DNA在ALDH2 rs671SNP位點(diǎn)表現(xiàn)為雜合“GA”或純合“AA”時(shí)，cDNA在對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)表現(xiàn)為鳥(niǎo)苷(G)，顯示出DNA與cDNA測(cè)序結(jié)果不符的情況。

2.3ALDH2 rs671(GG、GA、AA)3種基因型的基因頻率和cDNA的表現(xiàn)型 48例受試者ALDH2 rs671(GG、GA、AA)3種基因型的基因頻率見(jiàn)圖3A。在所研究的人群中，基因型為ALDH2 rs671(GG)的基因頻率最高，基因型為ALDH2 rs671(AA)的基因頻率最低(僅發(fā)現(xiàn)1例)。對(duì)48例受試者ALDH2 rs671SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的cDNA的核苷酸序列進(jìn)行計(jì)算，cDNA均表現(xiàn)為“G”，結(jié)果見(jiàn)圖3B。

注：A為以白細(xì)胞的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測(cè)序的結(jié)果，▼指示ALDH2 rs671SNP位點(diǎn)；B為以白細(xì)胞的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測(cè)序的結(jié)果，▼指示ALDH2 rs671SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的cDNA的位點(diǎn)。圖2 配對(duì)DNA與cDNA的測(cè)序結(jié)果

注：A為ALDH2 rs671(GG、GA、AA)3種基因型的基因頻率；B為ALDH2 rs671(GG、GA、AA)3種基因型的cDNA表現(xiàn)型。圖3 ALDH2 rs671(GG、GA、AA)的基因頻率和cDNA的表現(xiàn)型

3 討 論

ALDH2蛋白質(zhì)是以四聚體的形式在體內(nèi)發(fā)揮催化功能，基因型為雜合ALDH2 rs671(GA)的個(gè)體，主要是ALDH2蛋白質(zhì)第504位谷氨酸→賴氨酸(504E→504K)的改變[14-15]。然而，這種改變會(huì)導(dǎo)致ALDH2蛋白質(zhì)四聚體的穩(wěn)定性下降，從而降低ALDH2蛋白質(zhì)對(duì)乙醛的催化活性[16-17]。本研究的受試者中，基因型表現(xiàn)為雜合ALDH2 rs671(GA)的19例受試者，ALDH2 rs671SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的cDNA都表現(xiàn)為“G”，并未檢測(cè)到腺苷(A)(圖2B)，理論上ALDH2 mRNA翻譯出的蛋白質(zhì)并不會(huì)出現(xiàn)ALDH2(504E→504K)的改變。矛盾的是，LAI等[18]報(bào)道基因型為雜合ALDH2 rs671(GA)的個(gè)體ALDH2蛋白質(zhì)催化活性不到正?；钚缘?/2。因此，推測(cè)基因型表現(xiàn)為雜合ALDH2 rs671(GA)的受試者，ALDH2蛋白質(zhì)催化活性明顯降低并不完全是因?yàn)锳LDH2(504E→504K)的改變。一種原因可能是僅ALDH2的等位基因(G)被轉(zhuǎn)錄，等位基因(A)不被轉(zhuǎn)錄，ALDH2 mRNA的量相對(duì)減少，造成ALDH2蛋白質(zhì)的量相對(duì)不足，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)乙醛的代謝活性出現(xiàn)異常。盡管未檢測(cè)這些受試者ALDH2蛋白質(zhì)對(duì)乙醛的催化活性。對(duì)于基因型表現(xiàn)為雜合ALDH2 rs671(GA)的受試者，也許機(jī)體認(rèn)為等位基因(A)對(duì)于機(jī)體是“不利的”，因此，不轉(zhuǎn)錄等位基因(A)，而僅轉(zhuǎn)錄等位基因(G)。

RNA編輯被定義為一種協(xié)同/轉(zhuǎn)錄后修飾機(jī)制，通過(guò)在RNA水平上插入、刪除或替換核苷酸，導(dǎo)致RNA序列與其模板DNA之間的差異來(lái)改變序列信息；這種修飾可以發(fā)生在編碼區(qū)，從而重新編碼氨基酸，具有典型的矯正功能；在哺乳動(dòng)物中，由作用于RNA的腺苷脫氨酶(ADAR)催化的腺苷→肌苷(A→I)編輯是最常見(jiàn)的RNA編輯類型[19-20]。這種類型的RNA編輯在DNA水平表現(xiàn)為“A”，而對(duì)應(yīng)的cDNA卻表現(xiàn)為“G”，DNA與cDNA測(cè)序時(shí)出現(xiàn)A→G不符的情況[21-22]。在進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯時(shí)，由于I通常被識(shí)別為G，因此A→I編輯也稱為A→G編輯[23]。本研究中的48例受試者中基因型表現(xiàn)為罕見(jiàn)的純合ALDH2 rs671(AA)的受試者，ALDH2 rs671SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的cDNA也表現(xiàn)為“G”(圖2B)，DNA與cDNA測(cè)序出現(xiàn)A→G不匹配。因此，推測(cè)基因型表現(xiàn)為罕見(jiàn)的純合ALDH2 rs671(AA)的個(gè)體ALDH2 mRNA發(fā)生了(A→G)RNA編輯。有研究表明，基因型表現(xiàn)為純合ALDH2 rs671(AA)時(shí)，ALDH2蛋白質(zhì)的催化活性僅為正?；钚缘?%～5%[24]。然而，通過(guò)RNA編輯這種轉(zhuǎn)錄后的修飾機(jī)制，可以使原本DNA水平上異常的純合ALDH2 rs671(AA)在RNA水平矯正為正常的“G”，這是RNA編輯典型的矯正功能，在進(jìn)化上也是一種非常好的現(xiàn)象。

4 結(jié) 論

48例受試者中，19例基因型表現(xiàn)為雜合ALDH2 rs671(GA)的個(gè)體，ALDH2 rs671SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的cDNA都表現(xiàn)為“G”，基因型表現(xiàn)為罕見(jiàn)的純合ALDH2 rs671(AA)的個(gè)體，ALDH2 mRNA發(fā)生(A→G)RNA編輯，這些結(jié)果為ALDH2 rs671SNP如何影響人類健康的機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。