豆春麗，袁芳芳，劉斌，李慧，蘇磊,5*

1廣州中醫(yī)藥大學研究生院，廣州 510006；2中南大學湘雅三醫(yī)院血液科，長沙 410013；3長沙市第一醫(yī)院急診科，長沙 410005；4南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院重癥醫(yī)學科 廣州，510010；5全軍熱區(qū)創(chuàng)傷救治與組織修復重點實驗室，廣州 510010

重癥中暑是以核心體溫升高(＞40 ℃)、水電解質紊亂及中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙為特征的熱性疾病，并伴有全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)[1-3]。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國重癥中暑病死率為10%～15%，合并MODS時則高達40%，即使存活者也有30%以上遺留神經(jīng)、骨骼肌等系統(tǒng)的后遺癥。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，臟器損傷數(shù)目及程度與重癥中暑的預后密切相關，防治單一器官衰竭進展至MODS，在重癥中暑的發(fā)生、發(fā)展及轉歸過程中可能起關鍵作用。既往研究表明，橫紋肌溶解(rhabdomyolysis，RM)是重癥中暑尤其勞力型重癥中暑的常見合并癥[4]，橫紋肌溶解綜合征發(fā)生后其并發(fā)癥發(fā)生率高達51%，病死率高達32%，但中暑引起RM的具體機制尚不清楚[5]。研究表明，RM因肌細胞損傷及ATP能量代謝障礙致使橫紋肌細胞廣泛死亡，細胞膜結構的完整性改變引起細胞內(nèi)容物溢出，引發(fā)一系列危及生命的嚴重并發(fā)癥。但目前針對重癥中暑引起骨骼肌細胞損傷的相關研究較少。細胞脹亡是一種區(qū)別于凋亡的、caspase非依賴性的重要的促炎性細胞死亡方式，與急性冠脈綜合征、心肌缺血-再灌注損傷及惡性腫瘤等多種疾病密切相關[6-8]。但細胞脹亡是否參與重癥中暑RM的發(fā)生目前尚不清楚。本研究探討熱應激過程中骨骼肌細胞發(fā)生損傷的具體形式，以及重癥中暑RM的發(fā)生機制，以期為臨床救治提供靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 Porimin(G-2)抗體(sc-377295)購自美國Santa公司；CCK-8試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)毒性檢測試劑盒、ECL發(fā)光液購自碧云天生物技術研究所；Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒購自貝博公司；GAPDH抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；羊抗鼠IgG(H+L)-HRP、羊抗兔IgG(H+L)-HRP購自北京銳抗生物科技有限公司；caspase-3抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。普通倒置顯微鏡(YSK-319)購自日本Olympus公司；多孔板離心機購自杭州瑞誠儀器有限公司；細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher公司；透射電子顯微鏡購自日本日立新公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 人骨骼肌細胞株(HSKMC) 購自北納生物。HSKMC細胞復蘇后，1000 r/min離心5 min，棄上清，用高糖DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、10萬U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)重懸，轉入6 cm細胞培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長情況每2～3 d傳代1次，每周傳代2或3次。普通倒置顯微鏡下觀察細胞長至對數(shù)生長期時進行后續(xù)試驗，按照不同的處理方式分為對照組與熱打擊組。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期細胞，按100 μl/孔(5×104個細胞)的密度接種于96孔板中，待貼壁穩(wěn)定后，對照組細胞于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育；熱打擊組細胞于43 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h建立熱打擊細胞損傷模型，然后置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育0、6、12、24 h，分別設置5個復孔。復溫后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，并將培養(yǎng)板置于37 ℃孵箱內(nèi)孵育2 h。按照CCK-8試劑盒說明書操作，應用酶標儀測定450 nm處各孔吸光度(OD)值，計算細胞活力。

1.2.3 LDH法檢測細胞毒性 將適量細胞接種于96孔板中，待細胞長滿至80%～90%時進行檢測。各組細胞處理結束后，將細胞培養(yǎng)板用多孔板離心機400g離心5 min，吸除上清，加入150 μl LDH釋放試劑，混勻，重新置于細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h。然后將細胞培養(yǎng)板用多孔板離心機400g離心5 min。取各孔的上清液120 μl，轉移到新96孔板相應孔中，分別向各孔中加入60 μl LDH檢測工作液，混勻，室溫下避光孵育30 min，用酶標儀測定490 nm處各孔OD值，計算細胞毒性。

1.2.4 透射電子顯微鏡觀察細胞超微結構 熱打擊處理后，在各時間點收集細胞，用2.5%戊二醛固定液固定，4 ℃過夜，送南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學實驗科，透射電子顯微鏡下觀察細胞的超微結構。

1.2.5 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染色法檢測雙陽性細胞率 按Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒說明書步驟操作。熱打擊處理后，在不同時間點收集細胞，調整待測細胞濃度為1×106個/ml，預冷PBS潤洗2次，用400 μl(1×) Annexin Ⅴ結合液重懸細胞，在細胞懸液中加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC染色液，輕輕混勻并于4 ℃避光放置15 min，加入10 μl PI輕輕混勻并于4 ℃避光放置5 min，應用流式細胞儀檢測(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm)。

1.2.6 Western blotting檢測細胞porimin、caspase-3蛋白的表達 取對數(shù)生長期細胞(熱打擊后不同復溫時間點及對照組)，加入細胞裂解液(RIPA:PMSF=100:1)，提取總蛋白，采用BCA法定量總蛋白濃度，然后行SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳，將蛋白轉移至PVDF膜上，5% BSA室溫封閉1 h，洗膜后加入porimin一抗(1:500)、caspase-3一抗(1:1000)，4 ℃過夜，TBST洗3 次，5 m in/次，加入二抗(1:10 000)室溫孵育1 h，TBST洗3次，5 min/次， 使用化學發(fā)光劑ECL顯色、曝光。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，若方差齊，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗；若方差不齊，兩樣本均數(shù)比較采用t'檢驗；多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，若方差齊，組間比較采用LSD-t檢驗；若方差不齊，組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 熱打擊對HSKMC細胞活力及毒性的影響 CCK-8法檢測結果顯示，與對照組相比，熱打擊組復溫0h細胞活力即開始下降，且隨著時間的延長細胞活力不斷下降，呈時間依賴性(P＜0.05)。LDH法檢測結果顯示，與對照組相比，熱打擊組復溫0h細胞毒性即增強，且隨著時間的延長細胞毒性不斷增強，呈時間依賴性(P＜0.05，圖1)。

2.2 熱打擊后HSKMC細胞超微結構的變化情況 透射電子顯微鏡觀察結果顯示，對照組細胞表面具有豐富的微絨毛，線粒體、內(nèi)質網(wǎng)等細胞器結構清晰，核大濃染，形態(tài)不規(guī)則，染色質濃密，核仁大而清晰。熱打擊組細胞在復溫早期(0、6 h)表現(xiàn)為細胞腫脹、體積變大，胞質空泡化(有別于凋亡早期的細胞皺縮、胞質濃縮及出芽改變)，線粒體明顯腫脹，脫顆粒，雙嵴消失，核周間隙增寬，細胞核凝聚、固縮，部分包膜連續(xù)性中斷，符合脹亡早期表現(xiàn)；復溫晚期(12、24 h)表現(xiàn)為核仁溶解消失，細胞核碎裂、染色質邊集，胞質結構崩解呈顆粒狀，符合脹亡晚期表現(xiàn)，即脹亡樣壞死(圖2)。

2.3 熱打擊對HSKMC細胞雙陽性細胞率的影響 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染色法檢測結果顯示，與對照組相比，熱打擊組雙陽性細胞率呈進行性增高趨勢(P＜0.05，圖3)。

2.4 熱打擊對HSKMC細胞中porimin、caspase-3蛋白表達的影響 Western blotting檢測結果顯示，隨著復溫時間的延長，porimin蛋白表達呈增強趨勢，至復溫12 h時，表達最強(P＜0.05)。與對照組相比，caspase-3蛋白表達無明顯剪切活化(P＞0.05，圖4)。

圖1 熱打擊后不同復溫時間點HSKMC細胞活力及毒性的變化情況(n=3)Fig.1 Changes in HSKMCs viability and toxicity at different rewarming time points after heat stroke(n=3)

圖2 熱打擊后HSKMC細胞超微結構的變化情況(×8000)Fig.2 Changes of ultrastructure of HSKMCs after heatstroke(×8000)

圖3 熱打擊對不同復溫時間點HSKMC細胞雙陽性細胞率的影響Fig.3 The double positive cell rate in HSKMCs at different rewarming points after heat stroke

圖4 熱打擊后不同復溫時間點HSKMC細胞中porimin (A)、caspase-3蛋白(B)的表達Fig.4 Expression of porimin (A) and caspase-3 protein (B) in HSKMCs at different rewarming time points after heat stroke

3 討 論

重癥中暑是一種高發(fā)病率和高致死率的疾病[9]， 且合并MODS時病死率高達40%，RM是重癥中暑常見的并發(fā)癥[3]。重癥中暑骨骼肌損傷時，骨骼肌細胞的死亡方式尚未見報道。細胞脹亡是一種非典型的程序性細胞死亡方式，與線粒體功能障礙及胞內(nèi)ATP迅速減少有關，是近年來的研究熱點[6-7,10]。因此，本研究探討熱應激過程中骨骼肌細胞發(fā)生損傷的具體形式，建立HSKMC細胞重癥中暑模型并檢測細胞活力及毒性，結果發(fā)現(xiàn)，熱打擊可導致HSKMC細胞損傷。

細胞超微結構的變化是判斷細胞死亡方式的一項重要標準，也是判斷脹亡的有效方法。本研究采用透射電子顯微鏡觀察細胞的超微結構，結果顯示，對照組細胞表面具有豐富的微絨毛，線粒體、內(nèi)質網(wǎng)等細胞器結構清晰，核大濃染，形態(tài)不規(guī)則，染色質濃密，核仁大而清晰，熱打擊組細胞在復溫早期(0、6 h)表現(xiàn)為細胞腫脹、體積變大，胞質空泡化(有別于凋亡早期的細胞皺縮、胞質濃縮及出芽改變)，線粒體明顯腫脹，脫顆粒，雙嵴消失，核周間隙增寬，細胞核凝聚、固縮，部分包膜連續(xù)性中斷，符合脹亡早期表現(xiàn)；復溫晚期(12、24 h)表現(xiàn)為核仁溶解消失，細胞核碎裂、染色質邊集，胞質結構崩解呈顆粒狀，符合脹亡晚期表現(xiàn)(即脹亡樣壞死)。上述特征與細胞脹亡的形態(tài)學特征一致[11]。此外，通過流式細胞儀檢測PI與Annexin Ⅴ-FITC的結合情況，也可判斷細胞是否發(fā)生脹亡[12]。脹亡細胞可以與Annexin-Ⅴ、PI結合，呈現(xiàn)紅色和綠色熒光[Annexin-Ⅴ(+)、PI(+)]，即“雙陽性細胞”。本研究發(fā)現(xiàn)，熱打擊可導致HSKMC細胞出現(xiàn)雙陽性細胞，且呈時間依賴性。Caspase-3可啟動細胞凋亡[13]，本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，熱打擊后HSKMC細胞中caspase-3蛋白無明顯變化，表明熱打擊后骨骼肌細胞并未發(fā)生凋亡。Moinfar等[14]成功克隆并初步證實porimin特異性地表達于將要發(fā)生脹亡的細胞表面。Porimin是介導細胞脹亡的特異性蛋白，本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，熱打擊導致HSKMC細胞中porimin蛋白的表達增強，并呈時間依賴性。

綜上所述，本研究結果表明，熱打擊誘導HSKMC細胞發(fā)生了一種有別于細胞凋亡的caspase非依賴性細胞死亡方式——脹亡。