曹楚珩，何妍慶，梁綺琦，鐘家本，李素策，喬娜，陶志華

(廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院，廣州 510006)

1 概述

咸魚是通過(guò)添加食鹽腌制后風(fēng)干而成的魚類制品。因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、風(fēng)味獨(dú)特而深受消費(fèi)者的喜愛。咸魚中含有人體所必需的氨基酸、賴氨酸等；咸魚含有人體必需脂肪酸——不飽和脂肪酸，有助于大腦及神經(jīng)發(fā)育，對(duì)于提高孩子智力、防止動(dòng)脈硬化和心血管疾病等有重要作用；同時(shí)咸魚還含有豐富的維生素及礦物質(zhì)[1]。但是由于腌制咸魚含有高鹽，在腌制過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生硝酸鹽和亞硝酸鹽的混合物。除此之外，生產(chǎn)過(guò)程中還會(huì)添加硝酸鹽和亞硝酸鹽作為發(fā)色劑[2,3]。由于魚肉中微生物的作用，硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽具有一定毒性，作為強(qiáng)氧化劑，進(jìn)入人體血液后可使血液中正常的低鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)化成高鐵血紅蛋白，使其失去載氧功能[4]。人體攝入過(guò)多亞硝酸鹽后，在組織代謝作用下生成強(qiáng)致癌物質(zhì)亞硝胺,引起食物中毒甚至死亡，引發(fā)食管癌、胃癌、肝癌和大腸癌等[5,6]。

亞硝酸鹽引起的食物中毒現(xiàn)象屢見不鮮。2011年7月，在某市一酒店內(nèi)食用鮑魚湯而引發(fā)149人亞硝酸鹽食物中毒事件的報(bào)道。2012年7月，灤縣發(fā)生一起因食用亞硝酸鹽含量超標(biāo)的食物而中毒的報(bào)道。2016年，吳曉軍報(bào)道了1例因食用變質(zhì)南瓜而引起的亞硝酸鹽含量超標(biāo)現(xiàn)象。2016年6月，貴州報(bào)道了1例因食用酸菜而引發(fā)的亞硝酸鹽中毒現(xiàn)象[7-10]。

腌制咸魚中亞硝酸鹽的產(chǎn)生在目前階段仍無(wú)法避免。找到一種加工食用兼具的方法，是解決腌制咸魚中亞硝鹽降解的關(guān)鍵。近年來(lái)，已經(jīng)有通過(guò)乳酸菌發(fā)酵泡菜而降解泡菜中亞硝酸鹽的研究[11]，而腌制咸魚工藝過(guò)程不是乳酸菌發(fā)酵得到的產(chǎn)品，需要適合加工食用的方法降解亞硝酸鹽。研究表明，山葵、大蒜中含有的大蒜素、硒和維生素C等可阻斷硝酸鹽向亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化[12-14]。除此之外，大蒜中含有巰基化合物，能夠與亞硝酸鹽形成酯類化合物，從而降低亞硝酸鹽的含量，大蒜能夠阻斷亞硝胺等致癌物質(zhì)的合成，減少患癌的風(fēng)險(xiǎn)[15]。因此，利用大蒜的提取液研究對(duì)咸魚中亞硝酸鹽的清除效果，具有重要的應(yīng)用價(jià)值，能達(dá)到醫(yī)食同源的目的。

為探討大蒜提取液對(duì)咸魚中的亞硝酸鹽清除作用的影響，本文將對(duì)咸魚中的亞硝酸鹽含量進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算清除率，從而確定最佳的提取條件。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 材料與試劑

鮮魚、大蒜、亞鐵氰化鉀、冰乙酸、乙酸鋅、硼砂、鹽酸、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉。

2.2 儀器

725N紫外可見分光光度計(jì)、離心機(jī)、酸度計(jì)、電子天平、果蔬料理機(jī)、恒溫水浴鍋、真空抽濾器。

2.3 咸魚的腌制

挑選新鮮的魚7條，重量在60 g左右，清洗處理內(nèi)臟，晾干表面的水，其中4條咸魚涂抹1∶3濃度的鹽水至有鹽水析出，靜置20 h。

2.4 試劑的配制

亞鐵氰化鉀溶液(106 g/L)：稱取10.6 g亞鐵氰化鉀，用水溶解，并稀釋至100 mL。

乙酸鋅溶液(220 g/L)：稱取22.0 g乙酸鋅，用3 mL冰乙酸溶解，用水稀釋至100 mL。

飽和硼砂溶液(50 g/L)：稱取5 g硼酸鈉，溶于100 mL熱水中，冷卻后備用。

鹽酸(20%)：量取20 mL，用水稀釋至100 mL。

對(duì)氨基苯磺酸(4 g/L)：稱取0.4 g對(duì)氨基苯磺酸，溶于100 mL 20%鹽酸中，混勻置于棕色瓶中，避光保存。

鹽酸萘乙二胺(2 g/L)：稱取0.2 g鹽酸萘乙二胺，溶于100 mL水中，混勻置于棕色瓶中，避光保存。

亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(200 μg/mL，以亞硝酸鈉計(jì))：準(zhǔn)確稱取0.1000 g與110～120 ℃干燥恒重的亞硝酸鈉混合，加水溶解，移入500 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。

亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液(5.0 μg/mL)：臨用前，吸取2.50 mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于100 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度。

2.5 實(shí)驗(yàn)方法

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別吸取0.00,0.05,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30,0.35,0.40,0.45 mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(相當(dāng)于0.00,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09 μg亞硝酸鈉)，分別置于25 mL比色管中，然后分別加入1 mL 0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5 min后加入0.5 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺，加水至刻度，混勻，靜置15 min，同時(shí)做空白試劑。以空白樣調(diào)節(jié)零點(diǎn)，于波長(zhǎng)538 nm處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。亞硝酸鹽含量與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系見表1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

表1 亞硝酸鹽含量與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5.2 大蒜浸提液的制備

將大蒜剝皮、洗凈、晾干，稱取200 g于果蔬料理機(jī)中攪碎，用蒸餾水轉(zhuǎn)入燒杯中，水浴10 min，用紗布過(guò)濾，10000 r/min離心10 min，抽濾，得濾液備用。

2.5.3 咸魚的處理

將腌制咸魚置于果蔬料理機(jī)中攪碎，稱取2.5 g于100 mL錐形瓶中，加入6.25 mL飽和硼砂溶液，攪拌均勻，加入70 ℃約75 mL的蒸餾水，于沸水浴中加熱15 min，冷卻至室溫后，將樣品全部轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，然后加入2.5 mL亞鐵氰化鉀溶液和2.5 mL乙酸鋅溶液，加水至刻度，混勻，4000 r/min離心10 min，抽濾，得濾液備用。

2.5.4 清除率的測(cè)定

取10 mL 2.5.3所得濾液，置于25 mL比色管中，加入6 mL大蒜浸提液，用乙酸調(diào)pH至3.5，搖勻，靜置反應(yīng)一段時(shí)間，加入0.4%對(duì)氨基苯磺酸1 mL，搖勻靜置4 min，加入0.5 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺，搖勻，定容至刻度，靜置15 min。以試劑空白做參比，于波長(zhǎng)538 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算亞硝酸鹽的清除率。大蒜浸提液對(duì)亞硝酸鹽清除率的公式：

R=(A1-A2)/A1。

式中：R為清除率(%)，A1為未加大蒜浸提液時(shí)樣品溶液的吸光度，A2為加大蒜浸提液后樣品溶液的吸光度。

2.5.5 不同提取劑的影響

分別用蒸餾水和乙醇作為大蒜提取液的提取劑，通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析不同提取劑的清除效果。

3 結(jié)果與討論

3.1 大蒜浸提液清除腌制咸魚中亞硝酸鹽的最優(yōu)條件

探討大蒜浸提液與腌制咸魚中亞硝酸鹽的反應(yīng)介質(zhì)的pH值、大蒜浸提液濃度、大蒜浸提液浸提溫度、大蒜浸提液的量這4大因子，研究影響大蒜浸提液對(duì)腌制咸魚亞硝酸鹽清除效果的因素。

3.1.1 大蒜浸提液濃度對(duì)腌制咸魚中亞硝酸鹽的清除效果

將攪碎的蒸餾水和大蒜按照1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1的比例配制好，水浴加熱10 min，冷卻至室溫，10000 r/min 離心10 min，取上層清液備用。

取5份10 mL咸魚提取液，置于25 mL比色管中，分別加入上述大蒜提取液10 mL，反應(yīng)一段時(shí)間，加入0.4%對(duì)氨基苯磺酸1 mL，搖勻，靜置4 min，加入0.5 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺，搖勻，定容至刻度，靜置15 min。以試劑空白做參比，于波長(zhǎng)538 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算不同濃度的大蒜浸提液對(duì)腌制咸魚中亞硝酸鹽的清除率。

圖2 大蒜浸提液濃度對(duì)腌制咸魚中亞硝酸鹽清除率的影響

由圖2可知，大蒜浸提液濃度為3∶1時(shí)，清除率最高，為52.94%，濃度過(guò)高或者過(guò)低都不利于腌制咸魚中亞硝酸鹽的清除效果。

3.1.2 大蒜浸提液浸提溫度對(duì)腌制咸魚中亞硝酸鹽的清除效果

將攪碎的大蒜配制成濃度為3∶1的浸提液，分別在60，70，80，90，100 ℃的溫度下浸提，冷卻至室溫，10000 r/min 離心 10 min，取上層清液備用。

取5份10 mL咸魚提取液，置于25 mL比色管中，分別加入上述大蒜提取液10 mL，反應(yīng)一段時(shí)間，加入0.4%對(duì)氨基苯磺酸1 mL，搖勻，靜置4 min，加入0.5 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺，搖勻，定容至刻度，靜置15 min。以試劑空白做參比，于波長(zhǎng)538 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算不同溫度的大蒜浸提液對(duì)腌制咸魚中亞硝酸鹽的清除率。

圖3 大蒜浸提液浸提溫度對(duì)腌制咸魚中亞硝酸鹽清除率的影響

由圖3可知，大蒜浸提溫度為70 ℃時(shí)，清除率最高，為44.93%，溫度過(guò)高時(shí)，清除率下降，原因可能是大蒜提取液中的有效成分被破壞。

3.1.3 大蒜浸提液的量對(duì)腌制咸魚中亞硝酸鹽的清除效果

將濃度為3∶1的大蒜浸提液置于70 ℃水浴加熱10 min，冷卻至室溫，10000 r/min 離心 10 min，取上層清液備用。

取7份10 mL咸魚提取液，置于25 mL比色管中，分別加入大蒜提取液0，2，4，6，8，10，12 mL，反應(yīng)一段時(shí)間，加入0.4%對(duì)氨基苯磺酸1 mL，搖勻，靜置4 min，加入0.5 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺，搖勻，定容至刻度，靜置15 min。以試劑空白做參比，于波長(zhǎng)538 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算不同大蒜浸提液的量對(duì)腌制咸魚中亞硝酸鹽的清除率。

圖4 大蒜浸提液的量對(duì)腌制咸魚中亞硝酸鹽清除率的影響

由圖4可知，隨著大蒜浸提液用量的增加，腌制咸魚中亞硝酸鹽的清除率先升高后降低，當(dāng)大蒜浸提液用量為6 mL時(shí)，清除率最高，為31.25%。這可能是由于較少量的大蒜浸提液與腌制咸魚中的亞硝酸鹽未完全反應(yīng)，而較多量的大蒜浸提液與腌制咸魚中的亞硝酸鹽反應(yīng)完全后還有剩余，對(duì)吸光度產(chǎn)生了影響。

3.1.4 pH對(duì)腌制咸魚中亞硝酸鹽的清除效果

將濃度為3∶1的大蒜浸提液置于70 ℃水浴加熱10 min，冷卻至室溫，10000 r/min 離心 10 min，取上層清液備用。

取5份10 mL咸魚提取液，置于25 mL比色管中，分別加入大蒜提取液6 mL，用乙酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，反應(yīng)一段時(shí)間，加入0.4%對(duì)氨基苯磺酸1 mL，搖勻，靜置4 min，加入0.5 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺，搖勻，定容至刻度，靜置15 min。以試劑空白做參比，于波長(zhǎng)538 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算不同pH對(duì)腌制咸魚中亞硝酸鹽的清除率。

圖5 pH對(duì)腌制咸魚中亞硝酸鹽清除率的影響

由圖5可知，反應(yīng)介質(zhì)pH為3.5時(shí)，腌制咸魚中亞硝酸鹽的清除率最高，為30.49%。

3.2 不同提取劑的影響

圖6 不同提取劑清除率變化圖

由圖6可知，通過(guò)0～12 d對(duì)樣品的處理，并且通過(guò)分析測(cè)試得到水作為提取劑的清除效果最佳。最高在第11天，能達(dá)到68%的清除效果。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著大蒜浸提濃度的減小，清除率先增加后減小，在其他條件相同時(shí)，當(dāng)大蒜浸提液濃度為3∶1(水∶大蒜)時(shí)，清除率最高，為52.94%；當(dāng)大蒜浸提液浸提溫度為70 ℃時(shí)，清除率最高，為44.93%，浸提溫度超過(guò)70 ℃，清除率逐漸降低；隨著大蒜浸提液用量的增加，清除率先增高后降低，當(dāng)大蒜浸提液用量為6 mL時(shí)清除率最高，為31.25%；反應(yīng)液pH為3.5時(shí)清除率最高，為30.49%。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)可知不同提取劑的提取效果差別比較大，可以看出清除亞硝酸鹽有效物質(zhì)更易溶于水，而且亞硝酸鹽也易溶于水，用水作提取劑可以增大二者的接觸面積，從而提高反應(yīng)效率。

綜上，大蒜對(duì)腌制咸魚中亞硝酸鹽的清除作用最佳條件為：以蒸餾水作浸提劑，大蒜浸提液濃度為3∶1，大蒜浸提液浸提溫度為70 ℃，大蒜浸提液用量為6 mL，反應(yīng)液pH為3.5；最佳清除天數(shù)為11 d，能達(dá)到68%的清除率。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大蒜對(duì)腌制咸魚中亞硝酸鹽有清除作用，因此食用大蒜能有效除去腌制咸魚中的亞硝酸鹽，對(duì)人體的健康有一定的益處，達(dá)到醫(yī)食同源的效果。