劉芬，豐平仲，朱順妮，王博，王忠銘

（1 中國科學院廣州能源研究所，廣東廣州510640；2 中國科學院可再生能源重點實驗室，廣東廣州510640；3 廣東省新能源與可再生能源研究開發(fā)與應用重點實驗室，廣東廣州510640；4 中國科學院大學，北京100049）

溫室氣體的大量排放引起的全球變暖和其他的環(huán)境問題受到全世界的密切關注。即使在后工業(yè)時代，環(huán)境中溫室氣體的含量仍以驚人的速度增長[1]。CO2是主要的溫室氣體，目前，來自火電廠、鋼鐵制造、化學和石化等工業(yè)生產排放的煙道氣中的CO2在全球碳排放中占比巨大[2]。CO2是煙道氣的主要成分，依據來源不同，在各類煙道氣中體積分數(shù)為3%～30%[3]，實現(xiàn)煙道氣來源的CO2的利用對于實現(xiàn)碳減排具有重要意義。

微藻是一類能進行光合作用的微生物，光合效率高于陸生植物，而且環(huán)境適應性強、生長周期短，具有良好的固碳能力。據估計，生產100t 微藻生物質可固定183t CO2[4]，并且固定的CO2能轉化為蛋白質、油脂、多糖等產物，具有極高的利用價值，因此，微藻固碳技術有望成為緩解溫室效應的有效方法之一[5-6]。自Wodzinski 等[7]于1978 年提出微藻直接用于減排煙道氣以來，大量關于微藻固定煙道氣中CO2的研究被廣泛報道[8]。從煤火電廠廢水中分離出的兩種微藻在體積分數(shù)18%CO2下生長良好[9]，濃度為300mg/L 的水泥廠廢氣可以支持Desmodesmus abundans的生長[10]，而且已有關于火電廠煙道氣CO2用于大規(guī)模培養(yǎng)微藻制取生物燃料的報道[11]。這些研究得以成功的關鍵因素之一，是微藻對煙道氣中的COx、SOx、NOx等有毒氣體以及這些氣體在水中產生的生長限制效應有一定的抵抗力[12]。這種抵抗力是有限的，研究表明，微藻可以耐受一定程度的SOx和NOx，甚至可以把這些氣體作為養(yǎng)分利用[10]，但過量的有毒氣體會抑制微藻的生長[8]，所以部分研究通過控制培養(yǎng)基pH等策略以減弱有毒組分的影響[13]。微藻對煙氣的耐受性已成為微藻固定煙氣CO2的技術挑戰(zhàn)之一[14]，而且已有研究表明煙道氣會對微藻的淀粉、油脂等成分的積累產生影響[15-16]，這將影響微藻生物質的應用方向并有助于分析煙道氣成分對微藻生長的影響機制，但目前這一方面的研究還較少。探究煙道氣中有毒成分對微藻生長以及細胞成分的影響，對于利用微藻固定煙氣CO2的研究具有重要意義。

我國石油和天然氣資源匱乏，但煤儲存量豐富，約占總能源消耗的70%[17]。因此，不同于其他石油和天然氣資源豐富的國家，我國主要依靠煤作為化工原料來滿足人們對于化工產品的巨大需求。同時，煤的C/H比相對石油和天然氣較高，作為化工原料在生產過程中CO2排放更加密集。煤化工CO2排放已成為我國總CO2排放的重要來源[18-19]，實現(xiàn)對煤化工煙道氣的利用對于我國的碳減排工作十分重要。目前，關于微藻固定煤煙道氣CO2的研究鮮有報道。煤化工煙道氣中除了含有大量CO2外，還有H2S、SO2、NH3和NOx等污染物[20]，不同工藝過程產生的煙氣成分和濃度各不相同，例如，潔凈煤氣化廢氣中含有H2S 0.6%、NH34mL/m3[21]，焦爐煙 氣 中 含 有SO2200～500mg/m3[22]、H2S 6～8g/m3[23]。即使在達到排放標準后仍含有SO250～100mg/m3、NH330mg/m3、H2S 3mg/m3、NOx200～500mg/m3[24]，這些達到排放標準后的煙氣是利用微藻固定CO2的首選，但目前還不清楚這些雜質氣體是否會影響微藻對煤化工煙氣中CO2的固定。因此，本研究選取了三種典型的煤化工煙道氣毒性雜質氣體H2S、SO2、NH3，研究了其在不同濃度條件下對小球藻生長與細胞成分的影響，以確定小球藻對煤化工煙道氣毒性成分的耐受性，為未來利用微藻固定煤化工煙道氣CO2提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)條件

實驗藻種為Chlorella pyrenoidosa（C.pyrenoidosa），為中國科學院廣州能源研究所保存。培養(yǎng)基為BG-11 培養(yǎng)基，121℃滅菌15min 后使用。于直徑3.5cm、高60cm的柱式光生物反應器中裝液400mL培養(yǎng)至對數(shù)期備用。培養(yǎng)溫度為25℃，通入CO2(2%)與空氣的混合氣體，通氣量為0.3L/min，光照強度為200μmol/(m2·s)，24h連續(xù)光照。

1.2 實驗設計

實驗以BG-11 培養(yǎng)基為基礎，添加NaHS、Na2SO3、NH3·H2O 分別模擬H2S、SO2和NH3的主要溶解物，為探究持續(xù)累積影響狀態(tài)，實驗采用24h補加的方式。具體實驗設置如下：NaHS，0、0.2mmol/(L·d)、1mmol/(L·d)、4mmol/(L·d)；Na2SO3，0、1mmol/(L·d)、10mmol/(L·d)、40mmol/(L·d)；NH3·H2O(以 游 離 氨 計)，0、0.7mmol/(L·d)、7mmol/(L·d)、35mmol/(L·d)。每組設置兩個平行組。于直徑5.4cm、高35cm 的柱式光生物反應器中培養(yǎng)，裝液量400mL。其他實驗條件同1.1節(jié)，每24h取樣測試。

1.3 生長情況測定

1.3.1 生物量干重測定

生物量以細胞干重表示。將孔徑為1.2μm 的whatman 玻璃纖維濾膜于105℃烘干至恒重，記錄初始質量為M1（g）。取一定體積V（mL）的培養(yǎng)液濾過濾膜，105℃烘干至恒重，記錄質量為M2（g）。利用差量法計算得到生物量（g/L），見式(1)。

1.3.2 細胞形態(tài)

細胞形態(tài)用顯微照片表征。顯微照片由顯微鏡（OLYMPUS CX3）連接相機（MshOt）拍攝。

1.3.3 生物質組分的測定

總脂含量的測定采用Bligh-Dyer 法[25]；總糖含量測定使用改良的苯酚-硫酸法[26]；蛋白質含量由氮元素含量乘以6.25計算得到；元素分析用元素分析儀Vario EL cube測定。

1.3.4 生物質平均生物量產率

通過生物量干重計算微藻平均生物量產率P[g/(L·d)]，見式(2)。

式中，N1、N2分別為始末兩次測定的生物量干重，g/L；t1、t2分別為兩次測定的時間，d。

1.3.4 比生長速率

通過生物量干重計算微藻比生長速率μ（d-1），μ用式(3)計算。

1.4 數(shù)據統(tǒng)計分析

利用Origin 和IBM SPASS Statistics 軟件分析實驗結果。

2 結果與討論

2.1 三種典型毒性氣體對C.pyrenoidosa 生長的影響

2.1.1 NaHS對C.pyrenoidosa生長的影響

圖1 不同濃度NaHS對C.pyrenoidosa干重的影響

表1 不同濃度NaHS條件下C.pyrenoidosa的生物量生產率和比生長速率

H2S 的水溶液為硫氫酸，因此本實驗采用NaHS作為H2S的生成劑，探究H2S對C.pyrenoidosa的影響。S 元素是微藻生長的必需營養(yǎng)元素，HS-在富氧水體中極易被氧化為硫酸鹽，硫酸鹽易被微藻作為S 源吸收利用從而促進生長[27]。從圖1 可以看 到， NaHS 添 加 量 為0.2mmol/(L·d) 時 對C.pyrenoidosa的生長有促進作用，最后獲得的生物量產率和比生長速率均高于對照組（表1）。但是，隨著NaHS濃度的提高，生物質濃度有所下降；在添加量為1mmol/(L·d)時，生物質濃度略低于對照組，生物量產率和比生長速率均有所下降，但對C. pyrenoidosa藻細胞形態(tài)[圖2(c)]的影響不明顯。而當NaHS濃度升高到4mmol/(L·d)時，藻細胞的生長在培養(yǎng)初始階段會受到一定抑制，有明顯較長的停滯期，之后藻細胞恢復快速生長（圖1），因此導致該NaHS濃度條件下，藻細胞獲得相對較低的生物量產率和比生長速率（表1）。雖然硫酸鹽是微藻生長所需的重要營養(yǎng)鹽之一，但胞內累積過量的硫酸鹽可能會抑制微藻細胞的生長[28]。同時，很多研究認為H2S/HS-產生毒性的首要原因是它會抑制細胞色素c 氧化酶并降低細胞產能[29]；也有研究表明高濃度H2S 會導致菌體停滯期延長或停止生長[30]。并且，硫元素過量且快速進入植物代謝系統(tǒng)，則會引起組織塌陷等急性損傷[31]。在本實驗中，高濃度的NaHS 則直接造成大量C.pyrenoidosa細胞的破碎結團[圖2(d)]，這是造成生物質濃度在第1天出現(xiàn)下降趨勢的原因。從顯微照片中仍可以看到有些C.pyrenoidosa細胞形態(tài)沒有被明顯破壞，能夠耐受高濃度的NaHS。第2 天之后生物質濃度則緩慢上升，說明此時存活細胞的生長率已大于死亡率。存活細胞繼續(xù)生長繁殖，這也是高濃度組生物質后期有較大提升的原因，推測這部分細胞對硫酸鹽有更高的抗性。另外，到生長后期，培養(yǎng)液中部分HS-被空氣氧化析出單質硫，從而降低水中HS-的濃度，減少了對藻細胞的毒害。綜上可知，1mmol/(L·d)以下濃度的NaHS 對C. pyrenoidos的生長沒有明顯影響，則C.pyrenoidosa對H2S水溶物具有較好的抗性。

2.1.2 Na2SO3對C.pyrenoidosa生長的影響

SO2在水中主要以SO2-3的形式存在[32]。從圖3可以看出， 不同濃度Na2SO3的添加均對C. pyrenoidosa的生長產生促進作用。實驗中，Na2SO3添加濃度越高，獲得的藻細胞干重越大，生物量產率和比生長速率也隨之升高（表2）。在Na2SO3濃度為40mmol/(L·d)時，藻細胞的生物量產率和比生長速率達到最高，分別為0.55g/(L·d)和0.81d-1。Lava-Gil 等[10]的研究顯示，不同濃度SO2-3（＜245mg/L） 的添加均在一定程度上促進了Desmodesmus abundans和Scenedesmussp. 的 生 長。Jiang 等[33]則發(fā)現(xiàn)Scenedesmus dimorphus在Na2SO3添加量小于60mmol/(L·d)條件下均能較好生長，添加量小于20mmol/(L·d)有生長促進作用。研究表明，Na2SO3可作為微藻生長的唯一S源，部分SO2-3可轉化為SO2-4供微藻吸收利用，這可能是促進小球藻生物量提高的原因之一[34]。但是SO2-3可以直接影響CO2固定和能量代謝系統(tǒng)，過高濃度的硫元素會對生物體產生毒害作用[31]。而在本研究中，添加更高濃度的SO2-3仍能促進C. pyrenoidosa快速生長，由此說明該藻對SO2可能具有更強的耐受能力。通過顯微照片[圖4(d)]可以發(fā)現(xiàn)，高濃度Na2SO3培養(yǎng)組中的藻細胞直徑相對更小，并且出現(xiàn)細胞聚集現(xiàn)象。硫元素對細胞的生長和分裂等代謝過程具有調控作用，小球藻在細胞核分裂之前，其中的硫脫氧核糖核苷酸等含硫化合物含量顯著增加，而硫元素的缺乏則會抑制四尾柵藻的細胞周期[35]。結合生物質比生長速率結果（表2）推測，過量的Na2SO3可能使C.pyrenoidosa的細胞周期縮短，從而使繁殖速率提高，而細胞的集聚現(xiàn)象則可能是快速多分裂繁殖[36]的結果。本實驗中各濃度的Na2SO3都能促進C. pyrenoidosa的生長，并且高濃度的Na2SO3[40mmol/(L·d)]使該藻獲得最高的生物量產率和比生長速率，因此C.pyrenoidosa具有較大的潛力耐受煤化工煙氣中的雜質氣體SO2。

圖2 小球藻顯微圖片（40倍，2d）

圖3 不同濃度NaSO3對C.pyrenoidosa干重的影響

表2 不同濃度NaSO3條件下，C.pyrenoidosa的生物量產率和比生長速率

2.1.3 NH3·H2O對C.pyrenoidosa生長的影響

NH3在水體中主要形成NH3·H2O對微藻細胞產生作用。從圖5可以看出，當NH3·H2O的添加量為0.7mmol/(L·d)與7mmol/(L·d)時并未對C.pyrenoidosa的生長速率和生物量產生明顯影響，與對照組表現(xiàn)出相同的生長趨勢，生物量產率和比生長速率也與對照組相差不大（表3）。Goto等[37]發(fā)現(xiàn)，當培養(yǎng)液中NH+4-N濃度高達1600mg/L時，較NO2-3-N培養(yǎng)基仍會對Chlorella vulgaris的生長產生促進作用，但是理論上此時游離氨的含量僅為2.97mmol/L；當游離氨初始濃度為13.30mmol/L 時，則會在生長初期對Chlorella vulgaris產生生長抑制。比較可知，本實驗所用的藻種C.pyrenoidosa具有更高的氨氮耐受性。氮源是微藻生長最重要的營養(yǎng)元素之一，其濃度、可用性和氮源形式對微藻生長有重要影響[38]。氨氮是微藻生長優(yōu)先選擇的氮源形式，但是過高的濃度也會限制微藻的生長甚至導致微藻的死亡[39]。通常，游離氨與NH+4相比具有更大的毒性，會對微藻光合系統(tǒng)產生多重影響，從而限制微藻的生長[40-41]；而且不同種類的微藻對游離氨具有不同程度的耐受能力[42]。本實驗中游離氨的最高濃度約為35mmol/L，從圖6(d)可以看出，它直接造成了小球藻細胞的破碎死亡，但在其他濃度條件下微藻細胞未發(fā)現(xiàn)明顯異常。以上結果表明，C.pyrenoidosa可以在較高程度上耐受NH3水溶物的毒性，具有耐受煙道氣中NH3的潛力。

圖4 小球藻顯微圖片（40倍，4d）

圖5 不同濃度NH3·H2O對C.pyrenoidosa干重的影響

表3 不同濃度NH3·H2O條件下C.pyrenoidosa的生物量產率和比生長速率

綜 上 可 知， 微 藻C. pyrenoidosa對NaHS、Na2SO3及NH3·H2O均表現(xiàn)出較好的耐受性，只有在過高濃度下才會對生長和藻細胞形態(tài)產生影響，所以其在利用煤化工廠煙氣CO2時，具有較大潛力耐受H2S、SO2及NH3等雜質氣體。

2.2 三種典型毒性氣體對C.pyrenoidosa 生物質成分的影響

2.2.1 NaHS對C.pyrenoidosa生物質成分的影響

從表4可知，當NaHS的添加量低于1mmol/(L·d)時，對C.pyrenoidosa的細胞組成均無顯著影響（P＞0.05），僅當添加量為4mmol/(L·d)時，會對細胞蛋白質含量影響顯著（P＜0.05），使蛋白質含量較空白組提高7.13%。研究表明，微藻在硫限制條件下會阻礙蛋白質的合成，促進淀粉的積累，而氮素的缺乏會增加油脂的積累[43]。本實驗中硫元素、氮元素均充足，因此碳水化合物和油脂的含量未受影響。在王倩雅[35]的研究中，不同硫元素濃度下尖狀柵藻在生長過程中可溶性蛋白呈現(xiàn)下降趨勢，最終高硫組可溶性蛋白含量高于低硫組。本實驗中4mmol/(L·d)添加組微藻蛋白質含量升高的結果與之相符。元素組成與細胞成分的變化情況相同，僅有4mmol/(L·d)添加組存在明顯變化，較對照組N 元素含量提高7.07%，C 元素含量降低3.52%，高濃度HS-的存在可能影響了微藻的固碳能力。

表4 不同濃度NaHS培養(yǎng)C.pyrenoidosa生物質的生化組分和元素含量

2.2.2 Na2SO3對C.pyrenoidosa生物質成分的影響

從表5 可知， 當Na2SO3的添加量低于10mmol/(L·d)時，對C.pyrenoidosa的細胞生化組分無 顯 著 影 響（P＞0.05）， 僅 當 添 加 量 達 到40mmol/(L·d)時，會對細胞蛋白質和總糖含量產生顯著影響（P＜0.05），較對照組，蛋白質含量降低13.45%，總糖含量提高42.90%。SO2-3會對植物體部分氨基酸的合成產生影響，這也可能是導致蛋白質含量降低的原因[31]。在Liang 等[44]的研究中，亞硫酸鹽含量低于20mmol/L 同樣不會對小球藻的油脂含量產生影響。微藻細胞的元素組成僅有N元素的含量降低13.39%。

表5 不同濃度Na2SO3培養(yǎng)C.pyrenoidosa生物質的生化組分和元素含量

2.2.3 NH3·H2O對C.pyrenoidosa生物質成分的影響

從表6 可知，不同濃度NH3·H2O 的添加對C.pyrenoidosa總糖含量影響顯著（P＜0.05），對蛋白質含量影響極顯著（P＜0.01），對油脂含量無顯著影響（P＞0.05）。其中，蛋白質含量總體呈下降趨勢，總糖含量呈上升趨勢；較對照組，7mmol/(L·d)的添加量會使蛋白質含量降低8.28%，使總糖含量提高19.77%。從元素組成也可看出，不同濃度NH3·H2O的添加對微藻C、H元素含量影響不明顯，對N元素含量有顯著影響（P＜0.01）。

表6 不同濃度NH3·H2O培養(yǎng)C.pyrenoidosa生物質的生化組分和元素含量

綜上所述，本研究表明：中低濃度NaHS、Na2SO3及NH3·H2O的添加對C.pyrenoidosa細胞生化組分和N、C、H 元素組成影響不明顯，只有在過高濃度時會產生影響。微藻C.pyrenoidosa含有超過50%的蛋白質和20%左右的多糖和油脂，含有谷物蛋白中缺少的亮氨酸、精氨酸和賴氨酸，具有較高的蛋白質營養(yǎng)價值，是優(yōu)良的單細胞飼料蛋白來源[45]。因此，本研究還顯示利用該藻固定煤化工廠煙氣CO2后獲得的藻細胞具有作為動物飼料蛋白來源的潛力。

3 結論

本研究利用NaHS、Na2SO3和NH3·H2O 分別模擬H2S、SO2和NH3的主要溶解物，以探究煤化工煙道氣中三種典型雜質氣體對微藻的影響。主要結論如下。

（1）NaHS、Na2SO3和NH3·H2O 濃度分別低于1mmol/(L·d)、40mmol/(L·d)和7mmol/(L·d)時 對C.pyrenoidosa生長均無抑制作用，表明C.pyrenoidosa對H2S、SO2和NH3水溶物具有較高的耐受性，利用煤化工煙道氣培養(yǎng)微藻固碳具有可行性。

（2）NaHS、Na2SO3和NH3·H2O 的添加會對C.pyrenoidosa生物質組成產生不同程度的影響，但微藻生物質微藻蛋白含量多超過50%，可以作為蛋白飼料來源，可實現(xiàn)在固碳減排的同時收獲微藻生物質進行資源化利用。

另 外， 本 文 分 別 探 究NaHS、 Na2SO3和NH3·H2O對C.pyrenoidosa的毒性，未對其交互作用進行探究，下一步可設計交互實驗探究其共同存在時對微藻的交互影響；而且簡單的化合物并不能模擬氣體溶于水中的所有形式，因此未來可在此基礎上利用真實氣體進行實驗，以獲得更切實的實驗效果。